E.coli
 
 
ปัจจัยใดบ้างที่มีผลต่อ transformation efficiency ในการทำขั้นตอนการทำ ligation

- ดีเอ็นเออาจเกิดการ degrade เนื่องมาจากการปนเปื้อนของ nuclease
- ปริมาตรของ ligation reaction อาจไม่มากเกินพอ 5% ของ competent cell
- T4 ligase เกิดการทำงานเชื่อมต่อกันเอง ทำให้รบกวนหรือยั้บยั้งการทำงานของ electrotransformation
 


 

จะทราบได้อย่างไรว่าเอนไซม์ ligase ยังสามารถใช้งานได้ดีอยู่

เพื่อเป็นการตรวจสอบว่าเอนไซม์ ligase ใช้งานได้ดีหรือไม่นั้น อาจทำได้โดยลองเอา DNA ladder เช่น 1 kb DNA ladder มาทำการ ligation ดู แล้วเปรียบเทียบกับ 1 kb DNA ladder ที่ไม่ได้ทำการ ligation บน agarose gel หากเอนไซม์ ligase ยังใช้งานได้ดีอยู่จะปรากฎแถบ smear ของ DNA ladder ที่มีขนาดใหญ่ (high molecular weight) เยอะ และมีแถบเล็กๆน้อยกว่า หรืออีกทางหนึ่ง หากพบว่า activity ของเอนไซม์ ligase ลดลง อาจเป็นไปได้ว่า เกิดการ degradation ของ ATP ที่อยู่ในบัฟเฟอร์ จึงไม่ควรใช้บัฟเฟอร์ที่มีอายุนานเกิน 24 เดือน


 

สามารถทำการ freeze-thaw competent cells ได้หรือเปล่า

สามารถทำการ thaw และ re-freeze ได้อย่างน้อย 1 ครั้ง แต่ทั้งนี้ไม่แนะนำให้ทำการ freeze-thaw หลายๆครั้ง เพราะจะทำให้ transformation efficiency ลดลงประมาณ 10 เท่า


 

หากใช้ปริมาณดีเอ็นเอในที่จะนำเข้าเซลล์มากเกินที่แนะนำ จะมีผลทำให้ transformation efficiency ใน E.coli ลดลงหรือไม่

ลดลง เพราะการใช้ดีเอ็นเอในปริมาณมากเกินพอ จะทำให้ competent cells อิ่มตัวไปด้วยพลาสมิด จึงทำให้ efficiency ลดลง เช่น ถ้าใช้ 10 pg plasmid DNA แล้ว transform เข้า E.coli TOP10 จะได้ประสิทธิภาพ 1.0x109/ ug ของดีเอ็นเอ แต่ถ้าเพิ่มประมาณพลาสมิดดีเอ็นเอที่จะนำเข้าเซลล์เป็น 1 ng efficiency จะลดลงเหลือประมาณ 1.0x108/ ug ของดีเอ็นเอ ยิ่งถ้าใช้ประมาณพลาสมิดดีเอ็นเอสูงถึง 1 ug ยิ่งทำให้ประสิทธิภาพลดลงเหลือเพียง 1.0x106/ ug ของดีเอ็นเอ


 

สาร EDTA มีผลต่อลดประสิทธิภาพในการนำดีเอ็นเอเข้าเซลล์ (transformation efficiency) ใน E.coli หรือไม่

มีคะ เพราะ EDTA มีผลทำให้ประสิทธิภาพการนำดีเอ็นเอเข้าเซลล์ลดลง ดังนั้นเราจึงแนะนำให้ ทำการ heat inactive ligation ที่ 65oC เป็นเวลา 15 นาที แทนการเติม EDTA ลงไปเพื่อ inactivate ligation


 

chemically competent cells สามารถนำมาใช้กับชุด ClineMiner library construction kit ได้หรือไม่

ไม่แนะนำให้ใช้คะ เนื่องจากการทำ cDNA library นั้นต้องการประสิทธิภาพในการนำดีเอ็นเอเข้าเซลล์ที่ค่อนข้างสูง ซึ่งเหมาะกับ electro competent cells มากกว่า เพราะหากใช้แบบ chemically competent cells จะทำให้ประสิทธิภาพของ peimary clones ลดลงถึง 100 เท่าเมื่อเปรียบเทียบกับ electrocompetent cells


 

จะสามารถคำนวณหา transformation efficiency ได้อย่างไร (ถ้าใช้ 10 pg of pUC19 DNA)

สามารถคำนวณได้จากสูตรนี้


 


 

สำหรับ chemically competent cells นั้นในระหว่างการทำ heat shock สามารถใช้เวลาในการบ่มได้นานแค่ไหนและต้องมีปริมาตรเซลล์เท่าไหร

เวลาที่เหมาะสมที่สุดสำหรับการทำ heat shock สามารถเพิ่มขึ้นได้ตามปริมาตรของเซลล์ด้วยเช่น 50 ul ของ competent cells สามารถใช้เวลาในการ heat shock ได้คือ 42oC เป็นเวลา 30 วินาที หากปริมาตรของเซลล์ 100 ul สามารถใช้เวลาได้นานถึง 45 วินาที และถ้าเซลล์มีปริมาตร 250 ul สามารถเพิ่มเวลาได้นานถึง 60 วินาที ทั้งนี้เราแนะนำให้ทำ positive control ของ pUC19 ด้วย เพื่อดูประสิทธิภาพในการทำ transformation


 

Copyrights © 2015 & Gibthai Co., Ltd. All Rights Reserved