TriZol reagent
 
 
บริษัท Invitrogen มีสาร Trizol ให้เลือกกี่แบบและเหมาะกับตัวอย่างอะไรบ้าง

4 แบบ ดังนี้คะ
- Trizol reagent เหมาะสำหรับตัวอย่างที่เป็น tissues หรือ cells
- Trizol LS reagent เหมาะสำหรับตัวอย่างที่เป็นน้ำเช่น เลือด ซีรั่ม และ virus preparations
- Trizol Max Bacterial RNA isolation kit เหมาะสำหรับตัวอย่างที่เป็น bacteria
- Trizol plus RNA purification system เหมาะกับตัวอย่างที่ใช้ Trizol สกัดได้ แต่มีการผสมผสานเข้ากับการใช้ column


 

ถ้าต้องการสกัด RNA จากพืชจะสามารถใช้ Trizol ได้หรือไม่

ได้คะ แต่เราแนะนำให้ได้ Plant RNA isolation reagent ดีกว่า เนื่องจากสารตัวนี้ถูกออกแบบมาเพื่อแยก RNA จากพืชโดยเฉพาะ ทำให้ได้ผลผลิตที่สูง และสามารถใช้สกัด RNA จากส่วนประกอบของพืชทีสกัดได้ยากๆ เช่น เมล็ด หรือพวกต้นสน ซึ่งสารตัวนี้จะดีในแง่ช่วยกำจัดพวก phenolic compound และสารพวกแป้ง (starches) ได้ดี


 

ถ้าต้องการสกัด RNA จากตัวอย่าง formalin-fixed specimen โดยใช้ Trizol จะได้หรือไม่

ได้คะ แต่ต้องแน่ใจว่า paraffin จะไม่ละลายอยู่ใน Trizol โดยทำการ heat ชิ้นเนื้ออย่างรวดเร็วเพื่อเอา paraffin ออก ก่อน แล้วค่อยทำการสกัด RNA หากต้องการรายละเอียดเพิ่มเติมสามารถดูได้ตาม reference ตามนี้คะ Inoue, T., et. al., Pathology International (1996) Vol 46, Iss 12, pp. 997-1004.


 

จะต้องทำอย่างไรหากต้องการเก็บ RNA ที่สกัดด้วย Trizol ไว้ให้ได้นาน ๆ

ละลาย RNA ใน deionized formamide และเก็บไว้ที่ -70oC จะสามารถเก็บ RNA ได้นานถึง 1 ปี หากต้องการนำมาใช้ ก็ทำการตกตะกอน formamide โดยการเติม 0.2 m NaCl ปริมาตร 1 ใน4 ของ Ethanol และบ่มที่อุณหภูมิห้องไว้ 3-5 นาที แล้วนำไปหมุนเหวี่ยงที่ความเร็ว 10,000 xg เป็นเวลา 5 นาทีคะ


 

เลือดที่มีการเติมสาร EDTA และต้องการนำมาสกัด RNA ด้วย Trizol นั้น สาร EDTA จะมีผลต่อประสิทธิภาพการทำงานของ Trizol หรือไม่

จริงๆแล้ว EDTA มีผลต่อการทำงานของ Trizol เป็นอย่างมาก เพราะทำจะให้เกิด DNA contamination ดังนั้นหากต้องการเติมสารพวก anticoagulant กับตัวอย่างที่ต้องการสกัด RNA เราแนะนำให้ใช้ citrate แทน EDTA โดยใช้ความเข้นข้นของ citrate เป็น 3.8% (w/v) ใช้ในอัตราส่วน 0.5 ml ของ citrate ต่อ 4.5 ml ของเลือด แต่ทางที่ดีที่สุดเพื่อให้ได้ RNA ที่บริสุทธิ์และผลผลิตที่ดีควรทำการสกัดเลือดที่เก็บมาใหม่ๆ คะ


 

จะสามารถเติมสาร antifoaming ใน Trizol ได้หรือไม่ เพื่อป้องกันการเกิดฟองในระหว่างการบดสารตัวอย่างด้วย homogenizer

ใน trizol มีสารที่ทำหน้าที่ anti-foaming อยู่แล้ว ดังนั้นจึงไม่มีความจำเป็นที่จะต้องเติมสารเหล่านี้เข้าไปอีก แต่หากต้องการเติมลงไปจริงๆต้องมั่นใจว่าสารเหล่านั้นไม่ได้มีผลต่อการทำลาย RNA ที่สกัดมา


 

ทำไมแถบ RNA จึงหายไปเมื่อนำไปดูด้วยชุดถ่ายภาพภายใต้ UV box

เมื่อดีเอ็นถูก exposed ด้วยแสง UV เป็นเวลานาน ทำให้ RNA เกิดการเสียหายขึ้น ดังนั้นควรจะใช้เวลาในการส่องดูเจลให้สั้นที่สุด และควรทำการ stain และ destain gel ในที่มีดและทำอย่างรวดเร็ว


 

หากจะใช้ Trizol ในการสกัด RNA ต้องเลือกใช้หลอดทดลองแบบไหน

เนื่องจากใน Trizol มีสาร phenol ดังนั้นจึงควรใช้หลอดทดลองที่ทนต่อการกัดจาก phenol ซึ่งเราแนะนำให้ใช้หลอดทดลองที่ทำมาจาก polypropylene คะ


 

จะสามารถใช้เครื่องหมุนเหวี่ยงที่มีความเร็วต่ำ (table-top centrifuge) ในการปั่นแยก RNA โดยใช้สาร Trizol ได้หรือไม่

ได้คะ แต่อาจจะต้องใช้เวลาในการหมุนเหวี่ยงนานขึ้น คือ สามารถใช้ความเร็ว 2,600x g ได้ แต่ต้องใช้เวลาประมาณ 60 นาที ที่อุณหภูมิ 4oC ในขั้นตอนของการแยก และใช้เวลาประมาณ 30 นาที ในขั้นตอนของการปั่นตกตะกอน RNA


 

เราจะสามารถหลีกเลี่ยงการปนเปื้อนของ genomic DNA ได้อย่างไร หากจะต้องการสกัด RNA ด้วย TriZol reagent

หากต้องการลดโอกาสการปนเปื้อนจาก genomic DNA สามารถทำได้โดย นำตัวอย่างที่ผสมกับ Trizol แล้วไป หมุนเหวี่ยงที่ความเร็ว 12,000xg เป็นเวลา 10 นาที ที่อุณหภูมิ 4oC สารพวก Genomic DNA, cellular membrane และ polysaccharides จะรวมตัวกันเป็น pellet ส่วน RNA จะอยู่ในส่วน supernatant แล้วจึงเติม Chloroform เข้าไป หรืออีกทางหนึ่ง หลังจากทำการสกัด RNA เสร็จแล้ว ทำการ treat ด้วยเอนไซม์ DNase I เพื่อกำจัด genomic DNA ที่ไม่ต้องการออกก็ได้เช่นเดียวกัน


 

Trizol และ Trizol LS reagent มีความแตกต่างกันอย่างไร

สารทั้งสองตัวนี้เป็นสารพร้อมใช้ได้เลย ซึ่งสามารถนำมาใช้ในการสกัด RNA จากตัวอย่างได้อย่างสะดวกและง่าย ซึ่ง Trizol LS นั้นมีส่วนประกอบและวิธีการใช้งานรวมทั้งผลการสกัด RNA ได้ดีเช่นเดียวกับ Trizol แบบเดิม แต่ Trizol LS ถูกออกแบบมาเพื่อใช้งานสำหรับตัวอย่างที่เป็นของเหลว (liquid sample) เช่น เลือด หรือ virus preparation ในขณะที่ Trizol ใช้กับตัวอย่างที่เป็น cell culture และ tissues แต่ความแตกต่างที่สำคัญที่สุดระหว่างสารสองตัวนี้คืออัตราส่วนความเข้นข้นที่ใช้กับตัวอย่างซึ่ง Trizol LS จะต้องใช้ 10:1 ต่อตัวอย่าง แต่ Trizol จะใช้ 3:1 ในหมายความความหากใช้ Trizol LS เราจะต้องใช้ Trizol LS มากขึ้นเพื่อให้ได้ yield ที่ดี


 

Trizol reagent มีเสถียรภาพ (stability) ได้นานเท่าไหร

Trizol อยู่ได้นานถึง 12 เดือน แต่ทั้งนี้เราแนะนำให้เก็บที่อุณหภูมิ 2-8oC ดีที่สุดเพื่อให้อายุการใช้งานได้ยาวนานขึ้น


 

หากใช้ Trizol ในการสกัด RNA แล้วจะได้ส่วนของ aqueous phase มากน้อยแค่ไหน

หลังจากเติม chloroform แล้วจะได้ส่วนของ aqueous phase ซึ่งเป็นส่วนที่ RNA ละลายอยู่ ประมาณ 60% ของตัวอย่างทั้งหมด


 

ContactGibthai
Copyrights © 2015 & Gibthai Co., Ltd. All Rights Reserved
Privacy Policy |   Terms of Service