PrestoBlue
 
 
PrestoBlue™ Cell Viability Reagent ทำงานอย่างไร

ในขณะที่เซลล์ยังมีชีวิตจะพบสภาวะ reducing ที่อยู่ในไซโตพลาสมของเซลล์ ดังนั้นเมื่อสี PrestoBlue ซึ่งเป็นสี resazurin-based solution (สีม่วง) mens jewelry ผ่านเข้าไปในเซลล์ PrestoBlue จะถูก reduced กลายเป็นสี resorufin (สีแดง) ซึ่งมีคุณสมบัติเป็นสี fluorescence (emission ที่ 615±10 nm) ทำให้สามารถวัด cell proliferation ได้จากความเข้มของสีแดงที่เกิดขึ้น


 

PrestoBlue™ Cell Viability Reagent มี sensitivity เท่าใด

ได้มีการทดสอบ PrestoBlue เพื่อตรวจสอบ cell viability โดยใช้เซลล์จำนวนน้อย (102-105 cells/well) พบว่าค่า fluorescence intensity มีความแตกต่างจาก control (no cell)

รูปที่ 1. การทดลอง cell proliferation assay ของ Jurkat cells ซึ่งได้วัดปริมาณเซลล์ตั้งแต่ 102-105 cells/well โดยมี incubation time ที่ 10 min พบว่าแม้ปริมาณเซลล์น้อยสี PrestoBlue ยังสามารถวัดปริมาณความมีชีวิตของเซลล์ได้อยู่ และเมื่อมีการเพิ่มระยะเวลาของ incubation time เป็น 16 ชั่วโมงพบว่าเป็นการเพิ่มสัญญาณของ fluorescence ให้มากขึ้นด้วย


 

PrestoBlue™ Cell Viability Reagent สามารถวัดแบบ end-point assay ได้แบบเดียวหรือไม่

PrestoBlue สามารถใช้วัด cell proliferation ได้ทั้งแบบที่เป็น kinetic- และ end-point assay เนื่องจากคุณสมบัติของ PrstoBlue ที่ไม่เป็นพิษกับเซลล์ นอกจากนี้หลังจากทำการวัดความมีชีวิตของเซลล์ด้วย PrestoBlue แล้วยังสามารถนำเซลล์ไปเลี้ยงต่อได้ หรือนำไปทำ cell assay อื่น ๆ ต่อได้อีก ยกตัวอย่างเช่น Flow cytometry, transfection, protein expression และ อื่น ๆ
ในกรณีที่ไม่สามารถวัดได้ทันทีหลังจากหยอด PrstoBlue ผู้ทำการทดลองสามารถนำ test plate หุ้มฟลอยด์เพื่อป้องกันแสงจากภายนอก แล้วนำไปแช่เย็นที่ 4ºC ไว้ก่อนได้ แต่ต้องไม่เกินสามวัน การเก็บในลักษณะนี้จะไม่มีผลต่อค่า fluorescence หรือ absorbance ที่อ่านได้ หรือถ้าต้องหยุด reaction เนื่องจากป้องกันการอิ่มตัวของสี PrstoBlue ผู้ทำการทดลองสามารถ 3%SDS ลงใน reaction ได้ (เติม 50µL ของ 3%SDS ใน 100 µL assay) และสามารถเก็บไว้ที่อุณหภูมิห้องได้ไม่เกิน 48 hr
*หมายเหตุ หลังจากใส่ SDS แล้ว จะไม่สามารถนำเซลล์ไปเลี้ยงต่อได้เนื่องจาก SDS เป็นพิษกับเซลล์
 


 

เราต้องมีการกำหนด control และ ปริมาณของเซลล์ที่ต้องการทดสอบหรือไม่

ต้องมีการกำหนด control อย่างน้อยสองแบบ หนึ่งคือ No cell control เพื่อใช้ในการลบ background ที่เกิดจากการอ่านค่า สองคือ Untreated cell control เพื่อใช้เป็น negative หรือ internal control
ในเรื่องของ cell density ต้องมีการ optimize เนื่องจากเซลล์แต่ละชนิดก็มีอัตราการเพิ่มจำนวนแตกต่างกัน ดังนั้นจึงจำเป็นต้องทดสอบปริมาณเซลล์ที่ทำให้ผลการทดลองมีค่า linear มากที่สุด
 

รูปที่ 2. แสดงผลของการทำ two-fold serial dilution ของ Jurkat cell พบว่าที่จำนวนเซลล์ 0-105 cells/well เมื่อทำการบ่มเป็นเวลา 16 ชั่วโมงผลของการอิ่มตัวของสารทำให้ค่าไม่เป็น linearity (รูป 2A) แต่เมื่อทำการลดปริมาณจำนวนเซลล์ให้อยู่ในช่วง 0-1750 cells/well พบว่าให้ค่า linearity ที่ 16 ชั่วโมง (รูป 2B) ดังนั้นเมื่อต้องการวัดค่าแบบ kinetic assay การ optimize เพื่อหาจำนวนเซลล์ที่เหมาะสมจึงเป็นสิ่งสำคัญ


 

เราจำเป็นต้องละลาย PrestoBlue™ Cell Viability Reagent หรือไม่ และมีวิธีในการเก็บสารอย่างไร

ไม่จำเป็นเนื่องจาก PrestoBlue มาเป็นสารละลายที่มีความเข้มข้นเป็น 10x concentration สารเก็บที่ 4ºC ได้นานหนึ่งปี หรือตาม expiry date ที่ระบุข้างขวด


 

ถ้าเราเผลอว่าง PrestoBlue™ Cell Viability Reagent ทิ้งไว้ที่อุณหภูมิห้องข้ามคืน หรือนำไปแช่แข็ง จะยังนำมาใช้ได้อีกหรือไม่

PrestoBlue สามารถเก็บที่อุณหภูมิห้อง (ไม่เกิน22 ºC) ได้เป็นระยะเวลาหนึ่งปี ถ้านำไปแช่แข็งสามารถนำ PrstoBlue มาใช้ได้ แต่ไม่ควรเกิน 5 freez/thaw cycle


 

สามารถใช้ PrestoBlue™ Cell Viability Reagent กับ suspension cell และ primary cell ได้หรือไม่

สามารถใช้ PrestoBlue กับ suspension และ primary cell ได้
cheap jewelry


 

สามารถใช้ PrestoBlue™ Cell Viability Reagent กับ non-mammalian cell อย่างเช่น bacteria ได้หรือไม่

สามารถใช้ PrestoBlue กับ non-mammalian cell ได้ แต่ต้องมีการ optimization โดยเฉพาะในเรื่องของ incubation time


 

PrestoBlue™ Cell Viability Reagent เป็นพิษกับเซลล์หรือไม่

ไม่เป็นพิษกับเซลล์ ดังนั้นหลังจากทำการวัดด้วย PrestoBlue เซลล์สามารถนำไปเลี้ยงได้ต่อ แต่ต้องมีการเปลี่ยนเอาสีออก แล้วใส่ complete medium ลงไปแทน


 

Optimal incubation time ของ PrestoBlue™ Cell Viability Reagent คือเท่าไร และสามารถ incubate เป็นระยะเวลาข้ามคืนได้หรือไม่

Optimal incubation time ของ PrestoBlue คือ 10 นาที ถึง 2 ชั่วโมง ในกรณีที่จำนวนเซลล์น้อย สามารถเพิ่ม sensitivity ของสารด้วยการเพิ่มระยะเวลาในการบ่มได้ถึง 24 ชั่วโมง
แต่ต้องระวังในเรื่องของการ contamination จากแบคทีเรีย เนื่องจากจะทำให้ค่าที่อ่านได้ไม่ถูกต้องจากความเป็นจริง


 

Optimal incubation temperature ของ PrestoBlue™ Cell Viability Reagent เป็นเท่าไร

สามารถบ่มได้ที่ 37ºC/5%CO2 หรือที่อุณหภูมิห้องก็ได้


 

ถ้าเราไม่มีเครื่อง fluorescence microplate reader เราจะทำอย่างไร

สามารถวัด absorption โดยอ่านที่ความยาวคลื่น 570 nm ใช้ reference wavelength ที่ 600 nm


 

เราสามารถใช้ PrestoBlue™ Cell Viability Reagent ร่วมกับ cell assay (เช่น nucleic acid staining) อื่น ๆ ได้หรือไม่

ได้ โดยเคยมีการทดสอบกับ CYQUANT NF costume jewelry ซึ่งเป็นน้ำยาที่ใช้วัดปริมาณของ DNA ที่เพิ่มขึ้นตามการเพิ่มจำนวนของเซลล์ นอกจากนี้ยังสามารถนำไปใช้ร่วมกับงาน flow cytometry แต่ต้องเลือกสีที่ไม่ตรงกับ PrestoBlue เพื่อป้องกันการรบกวนของสัญญาณ


 

Copyrights © 2015 & Gibthai Co., Ltd. All Rights Reserved