PCR
 
 
ทำไมถึงได้ first strand cDNA product มีขนาดเล็ก อาจเล็กกว่า 2 Kb

- อาร์เอ็นเอต้นแบบโดยทำลายด้วยเอ็นไซม์ RNase ที่ปนเปื้อนมา อาร์เอ็นเอต้นแบบมีองค์ประกอบของ secondary structure มากอาจต้อง heat อาร์เอ็นเอก่อนเพื่อทำลาย secondary structure ที่ 70 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 10 นาที และ แช่ในน้ำแข็งต่อเพื่อ denature RNA หรืออาจต้องเพิ่มอุณหภูมิของ first strand reaction ให้สูงขึ้น หรือ denature อาร์เอ็นเอด้วย 20 mM methymercuric hydroxide

- ตรวจสอบ product ที่ได้จากการทำ RT-PCR ด้วย 1% alkaline agarose gel


 

เมื่อทำ RT-PCR นั้นสังเคราะห์ cDNA ออกมาได้น้อยเพราะเหตุใด

1. เพราะว่าคุณภาพของ mRNA ไม่ดี อาจต้องใช้วิธีการสักัดอาร์เอ็นเอออกมาจากเซลล์ด้วย guanidine isothiocyanate และตรวจสอบคุณภาพของอาร์เอ็นเอ 28s หรือ 18s ด้วย denaturing gel ก่อนนำมาทำ RT-PCR

2. RNA ที่นำมาใช้อาจถูกทำลายด้วยเอนไซม์ RNase ที่ปนเปื้อนเข้ามา

3. อาจมี inhibitor ปนเปื้อนมา อาจต้องกำจัด inhibitor ออกไป โดยล้างตะกอนอาร์เอ็นเอที่สกัดออกมาด้วย 70 % ethanol แล้วตกตะกอนอาร์เอ็นเอด้วย ethanol

4. มีการวัดความเข้มข้นของอาร์เอ็นเอที่เกินจริง ต้องวัดความเข้มข้นของอาร์เอ็นเอด้วย เครื่อง spectrometer ที่ A260
5. ไม่ได้เติม DTT ลงใน reaction ที่ทำ RT-PCR

6. อาร์เอ็นเอแม่แบบมีองค์ประกอบของ secondary structure ที่มากเกินไป อาจจะต้องเพิ่มอุณหภูมิในช่วง RT-reaction ให้สูงขึ้นประมาณ 50-65 องศาเซลเซียส หรือ heat อาร์เอ็นเอนั้นที่ 70 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 10 นาที และ แช่ในน้ำแข็งต่อเพื่อ denature RNA ก่อนทำ RT-reaction

7. ตัวอย่างที่นำมาทำ RT-PCR ไม่มีการแสดงออกของยีนที่ต้องการศึกษา


 

ประโยชน์ในการ treat first-strand product ด้วย RNase H คือ

RNase H เป็นเอนไซม์ที่ทำลาย สายอาร์เอ็นเอ ที่จับกับดีเอ็นเอ (RNA:DNA hybrids) ซึ่งทำให้เพิ่มปริมาณของ PCR product ที่ได้เพราะมี cDNA ที่เป็นต้นแบบในช่วงการทำ PCR เพิ่มมากขึ้น นอกจากนั้น RNase treatment จะช่วยเพิ่มจำนวน cDNA ที่มีความยาวมากและมี copy น้อย


 

เมื่อต้องการทำ RT-PCR ต้องใช้ระบบไหนในการทำระหว่าง one-step RT-PCR และ Two-step RT-PCR

One-step RT-PCR เป็น format ที่ง่าย รวดเร็ว และเป็นระบบที่ลดการปนเปื้อนระหว่างการเตรียม RT-PCR reactionได้ แต่อาจต้องใช้อาร์เอ็นเอเริ่มต้นมากในการทำ RT-PCR และจำเป็นต้องใช้ gene-specific primer เท่านั้น การใช้ระบบ one-step RT-PCR นั้นมีมีความไวในการสังเคราะห์สาย DNA สายใหม่ได้สูงกว่า Two-step RT-PCR โดยมีความไวถึง 0.01 pg จากอาร์เอ็นเอเริ่มต้น ส่วนระบบTwo-step RT-PCR นั้น มีประโยชน์ในการศึกษา multi message จากอาร์เอ็นเอตั้งต้นชนิดเดียว และสามารถเลือกใช้ primer ได้หลายแบบไม่ว่าจะเป็น gene specific primer, oligo(dT) primer หรือ random hexamer และเลือกใช้เอนไซม์ reverse transcriptase หรือ PCR enzyme ได้หลายชนิดกว่าระบบ one-step RT-PCR


 

สำหรับการสังเคราะห์สาย cDNA นั้นควรใช้ primer ชนิดใดระหว่าง oligo (dT), random hexamer, gene specific primer (GSP) ใช้ primer รวมทั้ง 3 ชนิด

ขึ้นอยู่กับงานที่ต้องการศึกษา
- Oligo(dT) เป็น primer ที่จำเพาะต่ออาร์เอ็นเอที่มี poly (A)ใช้กับ Total RNA, cDNA synthesis ซึ่งช่วยทำให้ได้ full-length cDNA แต่ปริมาณของ cDNA ที่ได้จากการใช้ Oligo(dT) นั้นจะค่อนข้างน้อ

- Random hexamer เป็น primer ที่นิยมใช้กัยอาร์เอ็นเอที่มี secondary structure เป็นองค์ประกอบภายในสายมาก ทำให้สังเคราะห์สาย cDNA ขึ้นมายาก เมื่อใช้ primer ชนิดนี้หลังจากที่ทำการเพิ่มปริมาณอาร์เอ็นเอแล้วจะได้ สาย first strand เส้นสั้นๆ เป็นจำนวนมาก ซึ่ง จะช่วยสังเคราะห์ cDNA ที่ปลาย 5’ ของอาร์เอ็นเอได้ด้วย

- ส่วน gene specific primer นั้น ไม่นิยมใช้มากนักในการสังเคราะห์ cDNA แต่อาจใช้ในการทำ 5’-RACE, qRT-PCR และถ้าตัวอย่างเป็น GC-rich template หรืออาร์เอ็นเอมีองค์ประกอบของ secondary structure มากจะไม่สามารถใช้ gene specific primer ในการสังเคราะห์ cDNA ได้ จึงมักนิยมใช้สังเคราะห์ cDNA ที่ต้องการและจำเพาะต่อสายอาร์เอ็นเอเท่านั้น


 

ก่อนทำ RT-PCR เพื่อกำจัดดีเอ็นเอที่ปนเปื้อนมาระหว่างขั้นตอนการสกัดต้องทำการ treat อาร์เอ็นเออย่างไร ก่อนเริ่มงาน RT-PCR

ต้องทำการผสมอาร์เอ็นเอ 1 ug กับ DNase buffer 1 ul และเอนไซม์ DNaseI 1 ul จากนั้นปรับปริมาตรให้เป็น 10 ul ด้วย DEPC-treated water และบ่มที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 15 นาที จากนั้นทำการ inactivate เอนไซม์ DNase I โดยเติม EDTA และ heat 15 นาทีที่อุณหภูมิ 65 องศาเซลเซียส หลังจากเสร็จขั้นตอนการ treat อาร์เอ็นเอเพื่อกำจัดดีเอ็นเอด้วย DNase นั้น สามารถนำอาร์เอ็นนี้ไปทำ RT-PCR ต่อได้


 

หลังจากที่ทำการเพิ่มสายดีเอ็นเอเส้นใหม่ และทำการแยกด้วย agarose gel electrophoresis พบ การปนเปื้อนหรือแถบดีเอ็นเออื่นนั้น สามารถแก้ไขได้ดังนี้

- อาจเกิดจากการจับกันอย่างไม่จำเพาะ non-specific ของดีเอ็นเอแม่แบบ กับ primer ซึ่งอาจต้องทำการเพิ่มอุณหภูมิและเวลาช่วง annealing ให้สูงขึ้นในช่วงการทำ PCR รอบแรกๆ จากนั้นจึงลดอุณหภูมิลง หรือเปลี่ยนมาใช้ hot-start enzyme

- เกิด primer-dimer อาจแก้ไขโดยออกแบบ primer ให้ไม่สามารถเข้าคู่กับลำดับทางปลาย 3’ ของดีเอ็นเอต้นแบบ

- ปรับแมกนีเซียมให้ไม่สูงเกินไป

- อาจเกิดจากการปนเปื้อนดีเอ็นเออื่น ระหว่างการทำ PCR ซึ่งอาจเปลี่ยนมาใช้ aerosol-resistant tip หรือ UDG

- ดีเอ็นเอแม่แบบอาจเพิ่มปริมาณได้ยาก อาจเปลี่ยนเป้นเทคนิค PCR แบบ nested PCR หรือ touchdown PCR
บางครั้งมีการเติม UDG ลงไป ก่อนการทำ PCR นั้น เติม UDG ลงไปทำไมและทำงานอย่างไร ตอบ Uracil DNA glycosylase (UDG) เป็นเอนไซม์ที่ทำหน้าที่ดึงเบส uracil จาก สายดีเอ็นเอ โดยการตัด N-glycosidic bond ที่เชื่อมระหว่าง uracil กับ suga-phosphate backbone ทำให้สายดีเอ็นเอไม่มีเบส uracil เรียกสายดีเอ็นเอสายนั้นว่า apyrimidic DNA ซึ่งดีเอ็นเอที่เป็น apyrimidic DNA จะถูกทำลายเมื่อเพิ่มอุณหภูมิให้สูงขึ้นพร้อมกับสภาวะที่ pH เป็นด่าง (ประมาณ pH 8.3) ดังนั้นในการทำ PCR เมื่อเปลี่ยนระบบจากที่ใช้เบส dTTP มาเป็น dUTP จะทำให้ PCR product ที่เกิดขึ้นมีเบส uracil แทนที thymidine เรียกว่า dU-PCR product ถ้า dU-PCR product เหล่านี้ปนเปื้อนไปในการทำ PCR ครั้งต่อไป เอนไซม์ UDG จะสามารถทำลาย dU-PCR product ที่ปนเปื้อนได้ ซึ่งเป็นการกำจัดการปนเปื้อนก่อนการทำ PCR วิธีหนึง


 

ถ้าไม่สามารถเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอสายใหม่ได้หลังจากทำ PCR แล้ว จะต้องทำอย่างไร

อาจต้องทำการปรับหาสภาวะเหมาะสมเช่น ปรับแมกนีเซียมเพราะอาจมีความเข้มข้นของ primer น้อยเกินไป
ปรับความเข้มข้นของ primer ให้อยู่ในช่วง 0.1 uM ถึง 0.5 uM ปรับความเข้มข้นของ ดีเอ็นเอแม่แบบ ถ้าใส่ดีเอ็นเอแม่แบบที่มากเกินไปอาจทำให้มีปริมาณของสารที่ปนเปื้อนหรือตัว inhibitor ที่มากเพิ่มด้วย
ปรับ annealing temperature ให้ต่ำลงเพราะอาจสูงเกินไปทำให้ primer จับดีเอ็นเอแม่แบบได้ไม่ดี
ดีเอ็นเอที่สกัดมาเป็นดีเอ็นเอแม่แบบอาจมีการปนเปื้อน inhibitor เช่น DMSO, SDS ,formamide ซึ่งจะขัดขวางการทำงานของเอนไซม์ Taq DNA polymerase ต้องกำจัด inhibitor ก่อนการทำ PCR


 

ทำไม platinum Taq DNA polymerase ถึงต่างจาก Taq DNA polymerase ธรรมดา

Platinum Taq DNA polymerase เป็น automatic hot-start enzyme ซึ่งเป็นเอนไซม์ที่ออกแบบmonoclonal Antibody ให้จับอยู่กับเอนไซม์ Taq DNA polymerase ซึ่งในสภาวะอุณหภูมิที่ยังไม่ถึง 94 องศาเซลเซียสนั้น เอนไซม์ Taq DNA polymerase ที่ถูก monoclonal antibody จับอยู่จะไม่ทำงาน แต่เมื่อทำ PCR อุณหภูมิถึง 94 องศาเซลเซียส antibody จะถูกทำลายและแยกออกมาจากเอนไซม์ Taq DNA polymerase ทำให้ Taq DNA polymerase ทำงานสังเคราะห์ ดีเอ็นเอเส้นใหม่ได้ตามปกติ โอกาสในการเกิด miss primer และ non-specific product จะไม่มากเท่ากับการใช้ Taq DNA polymerase


 

เมื่อสั่ง primer ความเข้มข้นที่ระดับ 50 nmole นั้น เมื่อได้รับ primer มาทำไมความเข้มข้นไม่เท่ากับ 50 nmol ที่ทำการสั่งเริ่มต้น

การสังเคราะห์ primer นั้นระดับของความเข้มข้นที่สั่งซื้อจะเป็นระดับความเข้มข้นที่เริ่มต้นใช้ในการสังเคราะห์ ไม่ใช่ระดับความเข้มข้นของ primer ที่ผ่านการสังเคราะห์แล้ว เช่นเมื่อสั่งซื้อ primer จากบริษัทใดก็ตามที่ระดับความเข้มข้น 50 nmole เริ่มต้นนั้นจะใช้ความเข้มข้นที่ 50 nmole สังเคราะห์ จากนั้นความเข้มข้นของ primer ที่สังเคราะห์เสร็จแล้วจะน้อยกว่าความเข้มข้นเริ่มต้น ทั้งนี้ความเข้มข้นที่น้อยลง เกิดจากปัจจัยหลายอย่างเช่น ในระหว่างขบวนการสังเคราะห์ primer มีขั้นตอนที่ทำให้ความเข้มข้นหายไป หรือ ความยาวของ primer ที่ต้องการสังเคราะห์ หรือลำดับเบสของ primer หรือองค์ประกอบของ GC ในลำดับเบส หรือการทำให้ primer บริสุทธิ์ขึ้นด้วยเทคนิค purification ล้วนเป็นปัจจัยที่ทำให้ความเข้มข้นของ primer ที่สังเคราะห์ได้นั้นลดลง


 

หลังจากที่สั่ง primer แล้วจะต้องเก็บ primer อย่างไรให้ใช้งานได้นานที่สุด

primer ที่ถูกส่ง มาในรูปแบบ lyophilized primer สามารถเก็บไว้ที่ -20 องศาเซลเซียส ประมาณ 1 ปี แต่เมื่อทำการละลาย primer ขึ้นมาใช้ด้วย TE buffer แล้ว primer นั้นสามารถเก็บไว้ใช้ได้ ประมาณ 6 เดือน ที่อุณหภูมิ -20 องศาเซลเซียส หรืออุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส ถ้าละลาย primer ด้วย เติมน้ำกลั่นนั้น สามารถเก็บไว้ที่ อุณหภูมิ-20 องศาเซลเซียส หรืออุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส ได้น้อยกว่า 6 เดือน ดังนั้นการเก็บ primer ให้ใช้งานได้นานนั้นควรเก็บใน TE buffer เพราะ ค่า pH ของน้ำนั้นเปลี่ยนแปลงเป็นกรดได้ง่ายซึ่งค่า pH ดังกล่าวจะสามารถ hydrolyse primer ทำให้ primer ที่ละลายด้วยน้ำกลั่นเก็บไว้ใช้งานได้ไม่นาน


 

ในการทำ PCR ถ้าต้องการเพิ่มความถูกต้องแม่นยำของ PCR product (fidelity) จะสามารถเพิ่มความถูกต้องแม่นยำได้อย่างไร

เนื่องจากเอนไซม์ Taq DNA polymerase ไม่มี 3’-5’ exonuclease (proof reading activity) ดังนั้น ถ้าเลือกใช้ proof reading enzyme จะช่วยทำให้มีความถูกต้องแม่นยำในสายดีเอ็นเอเส้นใหม่ที่สังเคราะห์ใหม่มากกว่าการใช้เอนไซม์ Taq DNA polymerase นอกจากการใช้ proof reading enzyme แล้วนั้น การลดความเข้มข้นของ dNTP จาก 200 uM ให้เหลือประมาณ 25-50 uM ก็สามารถช่วยให้เพิ่มความถูกต้องแม่นยำขึ้นได้


 

ทำไมแมกนีเซียมถึงมีความสำคัญในการทำงาน PCR

แมกนีเซียมมีผลต่อการทำงานของเอนไซม์ DNA polymerase ซึ่งช่วยปริมาณผลิตภัณฑ์ PCR ที่ได้ และช่วยให้เกิดการจับกันของ primer กับ ดีเอ็นเอต้นแบบอย่างจำเพาะได้ ซึ่งจะทำให้ได้ PCR product ที่ความจำเพาะขึ้น


 

ถ้าต้องการเติมแมกนีเซียมลงไปในงาน PCR ต้องทำการเติมลงไปเท่าไร

ส่วนใหญ่ในบัฟเฟอร์ที่เติมลงไปใน Reaction ที่ทำ PCR นั้นจะมีองค์ประกอบของแมกนีเซียมอยู่แล้วประมาณ 1.5 mM ถ้าต้องการปรับหาสภาวะที่เหมาะสมควรเติมแมกนีเซียมลงไปทีละ 0.5 mM โดยเริ่มต้นจาก 1 mM ถึง 3 mM


 

Copyrights © 2015 & Gibthai Co., Ltd. All Rights Reserved