T7 expression system
 
 
Plasmid Vector pBAD ทำงานอย่างไรและสังเคราะห์โปรตีนได้อย่างไร

pBAD expression system อาศัยการทำงานของ araBAD promoter ซึ่งเป็น arabinose operon คือ promoter จะถูกกระตุ้นให้ทำงานด้วยน้ำตาล arabinose หลักการคือ araBAD promoter จะถูกควบคุมการทำงานแบบที่เรียกว่า positive และ negative regulated จาก regulatory protein คือ AraC เมื่อมีน้ำตาล arabinose จะทำให้ AraC จับเป็นกลุ่มกับน้ำตาล arabinose ซึ่งทำให้ไม่มีการ form เป็น loop กั้นขวางการทำงานของ promoter ได้ เมื่อ promoter ทำงานก็จะกระตุ้นให้มีการสังเคราะห์โปรตีนที่สนใจได้ต่อไป ซึ่งระบบการสังเคราะห์โปรตีนแบบนี้เหมาะกับการสังเคราะห์โปรตีนที่เป็นพิษกับเซลล์ และสามารถใช้น้ำตาล arabinose ซึ่งมีราคาถูกใช้มาเป็นตัวกระตุ้นให้เกิดการสังเคราะห์โปรตีนได้แทนระบบ T7 expression system ซึ่ง IPTG ที่ใช้เป็นตัวกระตุ้นให้ T7 promoter ทำงานนั้นมีราคาแพง


 

เมื่อทำการสังเคราะห์โปรตีนออกมาแล้ว Epitope Tag ของ Invitrogen นั้นจะมีผลต่อรูปร่างหรือโครงสร้างของโปรตีนที่สนใจหรือไม่

ไม่มีผลเพราะขนาดของ Eptiope Tag นั้นมีขนาดค่อนข้างเล็ก เช่น
His (C-terminal) ขนาด 1 kDa
HisG (N-terminal) ขนาด 1 kDa
His-Xpress ขนาด 5 kDa
Myc ขนาด 1.1 kDa
Myc-His ขนาด 3 kDa
V5 ขนาด 1.5 kDa
V5-His ขนาด 3 kDa
Xpress ขนาด 1 kDa


 

เมื่อโปรตีนถูกสังเคราะห์ออกมาพร้อม Fusion Tag คือ 6XHistidine Tag สามารถทำการ purified โปรตีนที่ต้องการให้แยกออกมาจากโปรตีนตัวอื่น ๆ ได้อย่างไร

สามารถแยกโปรตีนที่ติดกับ histidine tag ออกมาได้โดยใช้ affinity purification column ซึ่งจะใช้ nickel-charged sepharose resin จับกับ Histidine Tag หลังจากนั้นจะใช้ elution buffer ที่มี pH ต่ำ หรือ imidazole buffer ไปแยกโปรตีนที่จับกับ resin ให้หลุดออกมาได้ในขั้นตอนสุดท้าย


 

ในระบบ T7 expression system สภาวะใดที่สามารถทำให้สังเคราะห์โปรตีนออกมาได้มากที่สุดเมื่อกระตุ้นให้เกิดการสังเคราะห์โปรตีนด้วย IPTG

IPTG ที่ใส่ลงไปในอาหารเลี้ยงเชื้อควรให้อยู่ในช่วงความเข้มข้น 0.1 mM ถึง 5 mM และอยู่ในช่วงความขุ่นของเซลล์ E.coli ที่ 0.4-0.6 OD600 โดยต้องทำการทดสอบหาโปรตีนที่สนใจทุกเวลา 0, 1, 2, 3 และ 4 ชั่วโมง ซึ่งโปรตีนที่สังเคราะห์ได้จะอยู่ในช่วง 100 ไมโครกรัม ถึง 10 มิลลิกรัมต่ออาหารเลี้ยงเชื้อหนึ่งลิตร


 

T7 expression system นั้นเป็นการสังเคราะห์โปรตีนโดยใช้ระบบใด And Buy Cheap

ระบบการสังเคราะห์โปรตีนโดยใช้เอนไซม์ T7 RNA polymerase (T7RNAP) และ T7 promoter ถูกค้นพบโดย Studier และคณะ ซึ่งเมื่อโคลนยีนที่สนใจใส่ลงไปใน plasmid vector ที่มี T7 promoter อยู่นั้นโปรตีนจะถูกสังเคราะห์ขึ้นมาโดยเอนไซม์ T7 RNA polymerase จะเข้าไปจับกับ T7 promoter ทำให้เกิดการถอดรหัสและแปลรหัสออกมาเป็นโปรตีนได้ ซึ่ง T7 RNA polymerase จะสร้างมาจาก E. coli host cell ซึ่งเป็นสายพันธุ์ที่มียีนที่สามารถสร้าง T7 RNA polymerase ได้ เช่น BL21(DE3) โดยยีนที่สร้าง T7 RNA polymerase ใน E. coli สายพันธุ์นี้จะถูกควบคุมการทำงานด้วย lacUV5 promoter และ promoter จะสร้าง T7 RNA polymerase เมื่อถูกกระตุ้นด้วย IPTG


 

สามารถใช้ E. coli สายพันธุ์ BL21 (DE3) ในการสังเคราะห์โปรตีนที่เป็นพิษต่อเซลล์ได้หรือไม่

ไม่ได้เพราะในสภาวะปกติที่ไม่ถูกกระตุ้นด้วย IPTG นั้น E. coli สายพันธุ์ BL21 (DE3) สามารถสังเคราะห์โปรตีนที่สนใจจาก recombinant clone ได้ ดังนั้นจะทำให้ถ้าต้องการสังเคราะห์โปรตีนที่เป็นพิษต่อเซลล์จะไม่สามารถใช้สายพันธุ์ BL21 (DE3) มาทำการสังเคราะห์โปรตีนนั้นๆ ได้ ซึ่งสายพันธุ์ที่ใช้สำหรับสังเคราะห์โปรตีนที่เป็นพิษต่อเซลล์ นิยมใช้สายพันธุ์ BL21(DE3) pLysE หรือ BL21(DE3) pLysS สายพัุนธุ์์เหล่านี้จะสร้างเอนไซม์ T7 lysozyme ออกมาย่อย T7 RNA polymerase ทำให้ในสภาวะที่ไม่ถูกกระตุ้นด้วย IPTG ก็ไม่มีการสังเคราะห์โปรตีนออกมา โปรตีนจะถูกสังเคราะห์ก็ต่อเมื่อมีการกระตุ้นด้วย IPTG


 

แอนตี้บอดี้ Anti-HisG สามารถ recognize กับโปรตีนที่ผลิตได้จาก plasmid pDEST 17 ซึ่งเป็น N-terminal His tag plasmid vector ได้หรือไม่

ไม่สามารถใช้ได้ เพราะ Anti-HisG antibody สามารถ recognize กับ N-terminal polyhistidine (6XHis) tag ตามด้วย glycine (HHHHHHG) เท่านั้น โดยโปรตีนที่ผลิตได้จาก pDEST17 vector ไม่มี glycine ต่อจาก 6XHis tag ทำให้ Anti-HisG ไม่สามารถ recognize ได้


 

ในระบบ T7 expression system ถ้าไม่สามารถสังเคราะห์โปรตีนได้หรือสังเคราะห์โปรตีนออกมาได้น้อย เกิดขึ้นจากสาเหตุใด

ต้องทำการตรวจสอบดูว่าลำดับเบสที่ทำการโคลนนั้นเข้าถูกตำแหน่ง (in frame) กับ C-terminal หรือ N-terminal epitope tag หรือไม่ หรืออาจทำการหาลำดับเบสของยีนที่โคลนเพื่อยืนยันว่าสามารถโคลนเข้าไปใน plasmid vector นั้นๆ ได้จริง หรือถ้ามีการสังเคราะห์โปรตีนออกมาน้อย อาจเนื่องมาจากความไม่สเถียรของ plasmid vector เมื่อใช้ amplicilin สำหรับทำการคัดเลือก อาจต้องเปลี่ยนมาใช้ cabenicillin (50ug/ml) แทน หรือโปรตีนที่ได้เป็นโปรตีนที่เป็นพิษ อาจเปลี่ยนไปใช้ e. coli สายพันธุ์อื่นที่สามารถสังเคราะห์โปรตีนที่เป็นพิษต่อเซลล์ได้


 

เมื่อทำการโคลนนิ่งได้และต้องการเลี้ยง recombinant clone ใน E. coli สายพันธุ์ BL21 จะสามารถทำได้โดยตรงเลยหรือไม่

สามารถเลี้ยงได้แต่ไม่นิยมเลี้ยงเพราะมีข้อจำกัดตรงที่ว่า E. coli สายพันธุ์นี้มียีน endA และ recA จึงทำให้ทำการเลี้ยงได้ยากและช้ากว่าสายพันธุ์อื่น ดังนั้นจึงไม่เหมาะสมกับการเลี้ยงเพื่อเก็บ recombinant clone นั้นไปใช้เรื่อยๆ ในสายพันธุ์ BL21 แต่เหมาะสมกับการเลี้ยงเพื่อทำการสังเคราะห์โปรตีน


 

ข้อแตกต่างระหว่าง Kozak consensus sequence และ Ribosome binding site คืออะไร

Prokaryotic mRNA จะประกอบด้วย shine-dalgano sequence หรือที่รู้จักกันดีคือ Ribosome binding site (RBS) ซึ่งประกอบด้วย Polypurine sequence คือ AGGAGG อยู่บริเวณ 5’ ของนิวคลิโอไทด์เริ่มต้น (AUG) ซึ่งบริเวณนี้จะจับกับ ribosome ซึ่งเป็นลำดับเบสที่เป็นคู่สมกับปลายด้าน 3’ ของ 16s rRNA ส่วนใน Eukaryotic (mammalian) mRNA มีลำดับเบสที่ทำให้เกิดการ translation ได้เช่นกันเรียกว่า Kozak sequence ซึ่งไม่ใช่ Ribosome binding site แต่เป็น translation initiation enhancer ซึ่งลำดับ consensus sequence ของบริเวณนี้คือ ACCAUGG (AUG เป็นลำดับเบสเริ่มต้น) แต่ Kozak sequence ในระบบยีสต์ และระบบ Drosophila จะมีความแตกต่างกันออกไป


 

E. coli สายพันธุ์ใดที่เหมาะกับการใช้ในระบบ pBAD inducible promoter

E. coli สายพันธุ์ TOP 10, TOP10F’, DH10B ซึ่งในสายพันธุ์เหล่านั้นมี genotype เป็น araBAD- และ araEFG+


 

ข้อดีของการใช้ TOP 10 ที่ดีกว่า DH5α คืออะไร

 

ContactGibthai
Copyrights © 2015 & Gibthai Co., Ltd. All Rights Reserved
Privacy Policy |   Terms of Service