Gateway technology คือระบบที่ออกแบบมาให้มีความง่ายในการ cloning และ subcloning ดีเอ็นเอที่สนใจเข้าเวคเตอร์ได้ เพื่อใช้ในการศึกษา  gene function, protein expression ซึ่งจะรวมอยู่ในขั้นตอนเพียงไม่กี่อย่าง คือเราสามารถที่จะทำการ clone ดีเอ็นเอที่สนใจเข้าเวคเตอร์ที่เรียกว่า Gateway entry vector และทำการย้ายชิ้นดีเอ็นเอจากเวคเตอร์นี้ไปสู่เวคเตอร์ตัวอื่นๆที่เป็นระบบ Gateway เหมือนกันได้ โดยอาศัย bacteriophage lamda-based site-specific recombinant ที่เรียกว่า att site ดังนั้นในกระบวนการทำ cloning จึงไม่ต้องการขั้นตอนการใช้ restriction enzyme และ ligase enzyme ในการทำ subcloning ยีน และข้อดีของ Gateway technology อีกอย่างคือ เราสามารถย้ายดีเอ็นเอจาก cloning vector ไปย้าย expression vector ที่เป็นทั้งระบบ prokaryotic, yeast, insect และ mammalian ที่เป็น destination vector ได้เลย โดยไม่ต้องทำการ cloning ใหม่คะ

ขนาดของชิ้นดีเอ็นเอที่ใหญ่มากที่สุดที่จะทำการ clone เข้าเวคเตอร์ TOPO adapted Gateway Entry vector คือ 5 kb แต่ทั้งนี้การเกิดปฎิกิริยา Gateway recombination นั้นสามารถใช้ DNA ที่มีขนาดใหญ่ได้ถึง 150 kb คะ

เอนไซม์ BP และ LR clonase II เป็นเอนไซม์ที่ผลิตขึ้นมาใหม่แทนที่เอนไซม์ BP และ LR clonase อันเก่า ซึ่งเอนไซม์ใหม่นี้แตกต่างจากตัวเก่าคือตัวใหม่มีการผสม buffer มาในหลอดเอนไซม์เรียบร้อยแล้ว ดังนั้นเวลาที่ใช้สามารถไปเปตไปใช้ได้เลยตามที่ protocol แนะนำ ในขณะที่ถ้าเป็นเอนไซม์ BP และ LR clonase ตัวเก่าจะต้องไปเปตเอนไซม์และ buffer มาผสมกันก่อนคะ

เราสามารถทำการ freeze-thaw เอนไซม์ clonase ได้ประมาณ 10 ครั้งคะ โดยไม่มีผลต่อการทำงานของเอนไซม์คะ แต่อย่างไรก็ตามเราแนะนำให้ทำการแบ่งเอนไซม์ออกเป็นหลอดเล็ก หลายๆ หลอด เพื่อสำหรับการใช้งานแต่ละครั้งดีกว่าคะ ทั้งนี้เอนไซม์ clonase II จะมีความเสถียรมากกว่า clonase ตัวเดิมมาก ซึ่งควรเก็บไว้ที่อุณหภูมิ -20oC ในขณะที่เอนไซม์ clonase ตัวก่อนตัวเก็บที่อุณภูมิ -80oC

ได้คะ ทำได้โดยเพิ่มเวลาในการทำปฎิกิริยา Gateway clonase reaction ที่อุณหภูมิห้องให้นานขึ้นเป็น 1-4 ชั่วโมง ซึ่งจะทำให้ประสิทธิภาพดีขึ้น 2-3 เท่า หรือจะทำการบ่มไว้ข้ามคืน ก็ทำให้จำนวนโคโลนีมากขึ้นประมาณ 5-10 เท่าคะ

โดยปกติแล้วดีเอ็นขนาดเล็กสุดที่เคยนำเข้าได้คือ 7 bp ซึ่งดีเอ็นเอจะต้องอยู่ระหว่าง att sites นะคะ แต่ทั้งนี้ดีเอ็นเอที่มีขนาดเล็กมากๆอาจจะมีผลต่อการทำงานของเอนไซม์ Topoisomerase คะ

จริงๆแล้ว AttB-PCR product ควรจะทำการโคลนเข้า pDONR โดยใช้ BP clonase ก่อน แล้วจึงใช้ LR clonase ทำการโคลนเข้า destination vector ที่หลัง แต่เราสามารถทำปฎิกิริยาที่กล่าวมาทั้งสองนี้ได้ในหลอดเดียวกันและทำพร้อมกันได้คะ

ไม่ได้คะ เนื่องจาก attL, attR และ attP sites มีค่อนข้างใหญ่คือประมาณ 100 bp, 125 bp, และ 233 bp ตามลำดับ ดังนั้นการจะสั่งไพรเมอร์ให้มี sites เหล่านี้เข้าไปด้วย จึงเป็นเรื่องค่อนข้างยาก เนื่องจากไพรเมอร์ส่วนใหญ่แล้วเราจะสั่งกันเป็นสายสั้นๆไม่เกิน 100 bp เท่านั้นดังนั้นเราจึงแนะนำให้เพิ่มจำนวน PCR product โดยให้มี attB site แทน เนื่องจาก attB site มีขนาดแค่ 25 bp เท่านั้น แล้วจึงโคลนเข้า pDONR  vector เพื่อให้สร้าง attL site ก่อน แล้วจึงทำการย้ายยีนที่สนใจเข้า destination vector ทีหลังคะ