Product Articles

High Resolution Melting (HRM) Technology

Life Science


High Resolution Melting (HRM) analysis เป็นอีกหนึ่งวิธีของการวิเคราะห์แบบ post PCR analysis ที่ค่อนข้างสำคัญ เพื่อใช้ในการระบุการเปลี่ยนแปลงลำดับเบสของดีเอ็นเอ ในบริเวณที่สนใจ (region of interest) โดยวิธีการนี้อาศัยการตรวจวัดความแตกต่างเพียงเล็กน้อยของ Melting curve ในขั้นตอนการทำ real-time PCR ซึ่งวิธีการนี้เหมาะสำหรับการวิเคราะห์ SNP genotyping, mutation scanning และ sequence scanning ในตัวอย่างของ DNA

หลักการการทำงานของ HRM จะอาศัยหลักการของการแยกของสาย dsDNA โดยมีปัจจัยคือ ความยาวของเส้น dsDNA GC content และความสมบูรณ์ของเส้น dsDNA โดยอาศัยสีที่มีความจำเพาะ รวมไปถึงเครื่อง real-time PCR พร้อม software ที่สามารถตรวจจับความแตกต่างของเส้น DNA.

ระหว่างขั้นตอนการเพิ่มปริมาณ DNA ที่สนใจหรือ amplicon โดยเทคนิค PCR ระหว่างนี้ intercalating dye ได้เข้าไปแทรกตาม double stranded DNA ทำให้ปริมาณสี fluorescence เพิ่มขึ้นตามปริมาณ Amplicon ที่เพิ่มขึ้นตามจำนวนรอบที่กำหนด

เมื่อสิ้นสุด PCR cycle จะเป็นการเริ่มต้นของขั้นตอน HRM โดย DNA จะถูกให้ความร้อนจากประมาณ 50 องศาเซลเซียส ไล่ไปเรื่อยๆจนถึง 95 องศาเซลเซียส ในขณะที่อุณหภูมิกำลังเพิ่มขึ้น เส้น DNA ได้เริ่มมีการแยกออกอันเนื่องมาจาก hydrogen bond ระหว่างเส้น DNA ถูกทำลายโดยความร้อน ระหว่างนี้สี fluorescence จึงได้มีการเริ่มสลายไป

รูปที่ 1. แสดงปริมาณสัญญาณ fluorescence ของ DNA Melt Curve High Resolution Melting Analysis ตามปริมาณของอุณหภูมิที่เปลี่ยนแปลงไป


ผลของการเปลี่ยนแปลงของอุณหภูมิในขั้นตอน Melting analysis จะแสดงอยู่ในรูปแบบของกราฟโดยแสดงความสัมพันธ์ระหว่างระดับของสัญญาณ fluorescence และอุณหภูมิที่เปลี่ยนแปลงไป จะเห็นได้ว่า หากมีความแตกต่างของเบสใน DNA ไม่ว่าจะเป็นการเปลี่ยนแปลงของลำดับเบสเพียงเล็กน้อยเช่น SNP หรือเป็นการเปลี่ยนแปลงของลำดับเบสในปริมาณที่มากเช่น Mutation จะส่งผลต่อการแปรผลของ HRM เพราะปัจจัยจาก GC content, Amplicon length และ strand complementarity  

 


รูปที่ 2. แสดง melting curve ของความแตกต่างของ base pair ระหว่างกลุ่มตัวอย่างที่เป็น Homogenous, heterogenous และ wildtype ระหว่าง 120 bp และ 220 bp ของ amplicon

อีกหนึ่งปัจจัยสำคัญนอกจากเครื่อง real-time PCR ที่สามารถรองรับระบบ HRM แล้วนั้น intercalating dye เองก็มีส่วนสำคัญเช่นเดียวกัน สีที่นิยมใช้ในการทำ HRM analysis ที่นิยมในปัจจุบันคือ Evagreen, SYTO9 ซึ่งเป็นสี saturated fluorescence ที่มีคุณสมบัติ PCR inhibition ที่ต่ำ ทำให้สามารถใส่ saturated fluorescence ใน PCR reaction ในความเข้มข้นที่สูงเพื่อให้เกิดสัญญาณ fluorescence มากที่สุดได้

Applications of HRM

  1. SNP Genotyping
  2. DNA Mapping
  3. Mutation Scanning
  4. Species Identification
  5. Zygosity testing
  6. DNA Methylation Analysis
  7. DNA Fingerprinting

ทางบริษัทกิบไทยได้มีการจัดจำหน่ายเครื่อง real-time PCR MIC ซึ่งรองรับการทำ HRM analysis และมีค่า acquisition time น้อยสุดอยู่ที่ 1 วินาที ทำให้ผลการทำ HRM มีความละเอียดมากยิ่งขึ้น รวมไปถึงมีค่า Uniformity เท่ากับ 0.01 องศาเซลเซียส ทำให้มีค่า error แต่ละ well น้อยมาก และนอกจากนี้ยังมีน้ำยา SensiFAST™ HRM Kit ซึ่งประกอบไปด้วยสี Evagreen จากบริษัท Bioline ประเทศอังกฤษจัดจำหน่ายอีกด้วย


Sensifast™ HRM Kit
 
MIC real-time PCR

สนใจสอบถามรายละเอียดเพิ่มเติมได้ที่
https://biomolecularsystems.com/mic-qpcr/  , https://www.bioline.com/us/sensifast-hrm-kit.html   หรือ ติดต่อแผนก Technical support e-mail: TAS@3nholding.com หรือฝ่ายงาน Life Science product โทร 022748331


X