Product Articles

Life Science

Genome Editing by Cas9 protein format

         

           การแก้ไขระดับ genome (Genome editing) ด้วยเทคนิค CRISPR-Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) เป็นการทำงานของ engineered nucleases ร่วมกับ endogenous repair mechanisms ที่มีความยืดหยุ่นสูง และจำเพาะต่อเป้าหมายด้วย CRISPR-Cas9 system ซึ่งเป็นเครื่องมือที่มีประสิทธิภาพที่สามารถแก้ไข genome ที่ทำให้เกิดการแทรก (insertion), การลบ (deletion) หรือ การแทนที่ (replace) ด้วยลำดับ DNA ในตำแหน่งที่จำเพาะบน genomic DNA โดย Engineered nucleases จะกระตุ้นให้เกิด double stranded break (DSB) บนตำแหน่งที่จำเพาะบน genome จากนั้น endogenous repair mechanisms จะทำหน้าที่ซ่อมแซม DNA ซึ่งกระบวนการดังกล่าวได้รับความนิยมเป็นอย่างมาก ทั้ง stem cell engineering, gene therapy, tissue, animal disease models และ engineering disease-resistant transgenic plants

          การทำงานของ CRISPR-Cas9 system จะประกอบด้วย short noncoding guide RNA (gRNA) ที่มี 2 ส่วนด้วยกันคือ target-specific CRISPR RNA (crRNA) และ auxiliary trans-activating crRNA (tracrRNA) ซึ่ง gRNA จะทำงานร่วมกับ Cas9 protein ซึ่งจะเข้าจับอย่างจำเพาะบน genomic DNA ด้วยการจับคู่ระหว่าง crRNA sequence และ target sequence (รูปที่ 1)

รูปที่ 1  องค์ประกอบของ CRISPR-Cas9 system ได้แก่ CRISPR gRNA และ Cas9 Protein

 

ในแบคทีเรียตำแหน่งของ CRISPR ประกอบด้วยชุดการซ้ำของ DNA ที่ถูกแยกออกมา ซึ่งเป็นส่วนของ endogenus DNA (ความยาวประมาณ 30 bp) หรือที่เรียกว่า spacers โดย repeat-spacer array จะถูก transcript เป็น long precursor และแปลง repeat sequences เป็นการสร้าง small crRNAs ที่จำเพาะต่อ target sequences บน gDNA ที่จะถูกตัดด้วย Cas9 protein ที่ทำหน้าที่เป็น nuclease ของ CRISPR system ที่มีการจดจำตำแหน่ง 3 nucleotide sequence motif (NGG) ของ downstream บน 3’ end ของ target region หรือที่เรียกว่า protospacer-adjacent motif (PAM) ที่จะปรากฎอยู่บน target DNA (รูปที่ 2)

รูปที่ 2 การทำงานของ CRISPR-Cas9 system

 

เมื่อ gRNA สร้าง complex ด้วยการจับกับ Ca9 protein ส่วน crRNA จะเข้าจับกับ target sequence จากนั้น Cas9 protein จะกระตุ้นให้เกิด specific double-strand break แล้วจะเกิดการซ่อมเซม DNA ด้วยกลไก cellular repair machinery through non-homologous end joining (NHEJ) หรือ homology-directed repair (HDR) (รูปที่ 3)

 

รูปที่ 3 การตัดด้วย CRISPR-Cas9 แบบ double-strand break บนตำแหน่ง 3 bp upstream ของ NGG proto-spacer adjacent motif (PAM) sequence ที่ 3’ end ของ target sequence

 

          ทาง ThermoFisher ได้เล็งเห็นถึงความสำคัญ และการใช้เทคโนโลยีในการทำ Genome editing จึงมีการออกแบบ Cas9 หลากหลายรูปแบบออกมา เพื่อรองรับการใช้งานของนักวิจัยที่ทำงานด้าน mammalian cellโดยเฉพาะ ประกอบด้วย Cas9 protein format, mRNA format, plasmid format และ LentiArray

          จากงานวิจัยพบว่า Cas9 protein format มีประสิทธิภาพสูงเมื่อเทียบกับ format อื่นๆ เนื่องจากสามารถทำงานร่วมกับ gRNA และเข้า cleavage DNA target ในระยะเวลาอันสั้น (รูปที่ 4)

 

 

รูปที่ 4 กระบวนการและระยะเวลาการทำงานของ Cas9 แต่ละ format ที่ถูกยืนยันด้วยการทำ Western Blot analysis

 

            ดังนั้นทาง ThermoFisher จึงได้มีการพัฒา Cas9 protein format ขึ้นภายใต้แนวคิด “Next-generation Cas9 protein designed to deliver maximum CRISPR editing efficiency” จากเดิม Invitrogen TrueCut Cas9 v2 ที่ออกแบบมาเพื่อการประยุกต์ใช้ในงานวิจัยเท่านั้น เป็น TrueCut Cas9 Protein (CTS-Prototype) สำหรับ pre-clinical research ที่จะต้องใช้ Cas9 nuclease ที่ผลิตด้วยข้อกำหนดที่เข้มงวด โดยผู้วิจัยสามารถเลือกใช้ TrueCut Cas9 ได้จากข้อมูลในตารางที่ 1

ตารางที่1 เปรียบเทียบสมบัติระหว่าง Invitrogen TrueCut Cas9 v2 และ TrueCut Cas9 Protein (CTS-Prototype)

Invitrogen TrueCut Cas9

Protein v2

Gibco TrueCut Cas9

Protein (CTS-Prototype)

- ประสิทธิภาพสูงเมื่อทดสอบใน cell line ทุกชนิดรวมถึง standard, primary, stem และimmune cell (>90% editing ใน T cells)

- มีประสิทธิภาพในการ editing มากถึง 2 เท่า ซึ่งสูงกว่าแม้จะเป็นเป้าหมายที่มีความซับซ้อน (difficult targets)

- ความบคุมคุณภาพภายใต้ ISO 13485 quality standards

 

 

 

 

 

 

 

- มีประสิทธิภาพสูงเมื่อทดสอบใน cell line ทุกชนิด (>90% editing ใน T cells)

- การผลิตที่เข้มงวดยิ่งขึ้นตามมาตรฐานสำหรับวัสดุเสริมสำหรับผลิตภัณฑ์จากเซลล์และเนื้อเยื่อ ซึ่งรวมถึง USP <1043>, Ph.Eur. 5.2.12 และ ISO 20399 -1, -2, -3 ตามหลัก 21 CFR Part 820 ในสถานที่ผลิตที่การขึ้นทะเบียนกับ FDA

- มีเอกสารการตรวจสอบย้อนกลับและการทดสอบความปลอดภัยที่ครอบคลุม bioburden, endotoxin, mycoplasma, residual host nucleic acids และ protein

- เป็นการผลิตที่ปลอดเชื้อด้วยการใช้ single-use technology

- การผลิตทำภายใต้ cleanroom Class A/B

- มีปริมาณหลากหลาย ได้แก่ 2.5, 5.0 mg ที่ความเข้มข้น 10 mg/m

 

 

 

ข้อมูลเพิ่มเติม:https://www.thermofisher.com/th/en/home/life-science/genome-editing/geneart-crispr/crispr-protein.html#ordergibco

หรือติดต่อแผนก Technical support e-mail: TAS@3nholding.com

หรือฝ่ายงาน Life Science product โทร 022748331

บทความโดย: ชุตินธร ช่วยวงศ์

ตำแหน่ง:Senior Technical Application Specialist for NGS and GeneArt Products


X