Technical Note : ข้อมูลทางเทคนิค

Real-time PCR technology

Life Science


Real-time PCR หรือที่รู้จักกันในชื่อ Quantitative PCR (QPCR) เป็นเทคนิคที่ถูกพัฒนามาจากการทำ PCR แบบดั้งเดิม (conventional PCR) โดยใช้การติดฉลากด้วยสารเรืองแสงประเภท fluorochrome

Real-time PCR หรือที่รู้จักกันในชื่อ Quantitative PCR (QPCR) เป็นเทคนิคที่ถูกพัฒนามาจากการทำ PCR แบบดั้งเดิม (conventional PCR) โดยใช้การติดฉลากด้วยสารเรืองแสงประเภท fluorochrome ทำให้สามารถวัดปริมาณของดีเอ็นเอเป้าหมายตั้งต้นจากสิ่งต้องการตรวจวัดได้และสามารถวัดปริมาณดีเอ็นเอที่เพิ่มขึ้นมาได้ทันที โดยไม่จำเป็นต้องรอให้กระบวนการเสร็จสิ้นก่อน วิธีการ real-time PCR เป็นวิธีการหาปริมาณดีเอ็นเอที่เพิ่มขึ้นในปฎิกิริยา PCR ในแต่ละรอบทำให้ได้ค่าปริมาณดีเอ็นเอที่เพิ่มจำนวนจริงจากค่าของ exponential phase ที่ได้จากการเริ่มต้นของดีเอ็นเอเป้าหมาย

การตรวจสอบทางเคมีของ real-time PCR

1.ใช้สีที่สามารถแทรกจับกับเส้นดีเอ็นเอ ตัวอย่างสีที่ใช้ได้แก่ SYBR-Green I Dye ซึ่งเป็นสีฟลูออเรสเซนต์ที่สามารถเข้าจับกับดีเอ็นเอตรงตำแหน่ง minor groove ของดีเอ็นเอสายคู่ได้ เมื่อสารนี้ถูกกระตุ้นด้วยแสงอัตราไวโอเลต จะมีการคายพลังงานออกมาเป็นแสงของฟลูออเรสเซนต์ ในช่วงการ denature เพื่อคลายสายดีเอ็นเอจากเส้นคู่ให้กลายเป็นเส้นเดี่ยวนั้น SYBR Green I จะยังไม่สามารถเข้าจับกับเส้นดีเอ็นเอเส้นเดี่ยวได้ แต่เมื่อเริ่มมีการสังเคราะห์ดีเอ็นเอเส้นใหม่ SYBR Green I จะเริ่มแทรกตัวเข้าไปในดีเอ็นเอเส้นคู่ และเรืองแสงเมื่อถูกกระตุ้นด้วยแสงอัลตราไวโอเลต แต่เมื่อรอบของ PCR กลับมาถึงช่วงการ denature อีกครั้ง SYBR Green I ก็จะหลุดออกจากสายดีเอ็นเอ ทำให้การเรืองแสงลดลงอีกครั้ง โมเลกุลของสีจะจับได้มากน้อยขึ้นกับความยาวของ PCR product  รูปที่ 1



2. ใช้ probe ที่ติดฉลากด้วยสีฟลูออเรสเซนต์ซึ่งเป็นสารเรืองแสง เป็นการตรวจสอบ โดย fluorescence resonance energy transfer (FRET) วิธีจะใช้เมื่อต้องการความจำเพาะสูง ซึ่งการใช้ SYBR Green I dye ไม่สามารถทำได้ วิธีนี้ทำได้นำ fluorchrome หรือสีฟลูออเรสเซนต์ 2 ประเภท ติดฉลากเข้ากับสาย probe เมื่อ probe ถูกกระตุ้นด้วยแสงพลังงานสูง fluorochrome ตัวแรก (Quencher) จะดูดพลังงานเอาไว้ และถ่ายทอดพลังงานให้ fluorochrome ตัวที่สอง (reporter dye) โดยไม่สูญเสียพลังงานออกมาสู่ระบบภายนอกในรูปของแสง การติดฉลากด้วยฟลูออเรสเซนต์และนำมาใช้ในการไฮบริไดเซซันมี 3 แบบคือ

2.1 TaqMan hybridization probes เป็น probe เส้นเดี่ยว ประกอบด้วย reporter dye ที่จับอยู่ปลาย 5’ ของ probe สี fluorescein นี้ได้แก่ FAM, TET และ HEX ส่วน Quencher dye จะจับที่ปลาย 3’ ของ probe เช่น TAMRA เมื่อเกิดการไฮบริไดเซซัน สี Fluorescein ของ reporter จะถูกกระตุ้น (excite) และปล่อยแสง (emit) ในการทำ real-time PCR เมื่อปฎิกิริยา extension เกิดขึ้น Taq DNA polymerase ที่มี 5’ nuclease activity จะตัด reporter dye ออกจาก probe ทำให้ reporter dye หลุดห่างออกจาก quencher dye และสามารถคายพลังงานออกมาในรูปของแสงฟลูออเรสเซนต์ รูปที่ 2

2.2 Molecular beacon probes เป็น probe ที่มีโครงสร้างเป็น hairpin loop เมื่อยังไม่ได้ไฮบริไดเซซันกับดีเอ็นเอเป้าหมาย มีลำดับเบสที่เป็นส่วนของ loop ที่ใช้ในการไฮบริไดเซซัน และส่วนที่สามารถจับกับเบสคู่สมได้ หลังจาก probe เข้าจับกับดีเอ็นเอเป้าหมาย hairpin จะถูกสลายไป ทำให้ reporter fluor อยู่ห่างจาก quencher dye และปล่อยแสงฟลูออเรสเซนต์ออกมาเมื่อถูกกระตุ้นด้วยพลังงานสูง  รูปที่ 3   



2.3 Scorpion probes เป็น hairpin loop ที่เชื่อมกับปลาย 5’ ของ primer หลังจากปฎิกิริยาในการ extension แล้ว probe สามารถที่จับกับเบสคู่สมในโมเลกุลดีเอ็นเอเป้าหมาย ทำให้โมเลกุล hairpin loop ของ probe ถูกเปิดออก ไม่มีการ quencher ของฟลูออเรสเซนต์ และเกิดการเพิ่มสัญญาณตรวจวัดได้ รูปที่ 4




3. ใช้ hybridization probe หรือ fluorescence resonance energy transfer (FRET) probe เป็น probe ที่อาศัการถ่ายเทพลังงานจากสีฟลูออเรสเซนต์ไปยังอีกสิ่งหนึ่ง โดยมีโอลิโกนิวคลีโอไทด์ ที่มีลำดับเบสจำเพาะ 2 สาย ติดฉลากด้วยสีฟลูออเรสเซนต์ เส้นแรกเป็น upstream probe ซึ่งเป็นโมเลกุลผู้ให้ทางปลาย 3’ ส่วนอีกเส้นเป็น downstream probe ซึ่งเป็นโมเลกุลผู้รับ ทางปลาย 5’ probes ทั้งสองเส้น มีการออกแลลให้ไฮบริไดซ์ที่บริเวณใกล้กันบนโมเลกุลดีเอ็นเอเป้าหมาย ซึ่งทำให้ฟลูออเรสเซนต์ที่ติดอยู่บนโมเลกุลของ probes ทั้งสองเส้น เข้ามใกล้กันและเกิดการถ่ายเทพลังงาน ทำให้สามารถตรวจสอบแสงฟลูเรสเซนต์ได้ รูปที่ 5



เครื่องสำหรับทำ Real-time PCR

ในปัจจุบันมีหลายบริษัทที่ผลิตเครื่อง real-time PCR ราคาแต่ละบริษัทก็จะแตกต่างกันออกไปขึ้นอยู่กับ Spec ของเครื่องและความสารถในการ detect สี ว่าสามารถอ่านสีได้กี่สีในเวลาเดียวกัน จำนวนของตัวอย่างที่ใช้ มีตั้งแต่ 12, 14, 36, 48 และ 96 สำหรับเครื่อง real-time PCR ที่มีขายอยู่ปัจจุบันได้แก่ ABI (prism 7000, 7300, 7700, StepOne, 7500 standard, 7900 HT), Bio-Rad (iCycler iQ), MJ (Opticon 2, Chromo 4), Stratagene (Mx4000, Mx3000P, Mx3005P), Corbett (Rotor gene), Eppendorf (Mastercycler) และ Esco ซึ่งบริษัทกิบไทย เป็นตัวแทนจำหน่าย สำหรับตัวเครื่อง Esco มีคุณสมบัติคือ สามารถ detect fluorescence dye ได้ 9 สี (TaqMan®probes, FAM, SYBR Green I, Molecular Beacons,  HEX, TAMRA, Vic,Texas Red, ROX) มี 4 multichannel, ทำได้ 48 ตัวอย่าง
สามารถเข้าไปดูรายละเอียด spec เครื่อง Esco swift 48 thermal cycler
www.escoglobal.com/lifesciences หรือเข้าไปโหลดรายละเอียดเครื่องได้ที่
www.escoglobal.com/lifesciences/PDF/OW8541_4_Spectrum48.pdf  
 น้ำยาที่ใช้กับเครื่อง real-time PCR
การทำ Real-time PCR มีส่วนประกอบของสารหรือส่วนประกอบต่างๆคล้ายกับการทำ conventional PCR ทั่วไป แตกต่างกันที่ fluorescence dye ที่ใส่เพิ่มเข้ามา ดังนั้น น้ำยาหรือ kit ที่ใช้ทำ real-time PCR จึงมีสองแบบหลักๆ คือ ใช้ระบบ SYBR Green reagent system และ Probe system (Taqman, molecular beacon, scorpion) ซึ่งน้ำยา Invitrogen มีให้เลือกทั้งการใช้ SYBR Green และ probe และสามารถใช้ได้กับเครื่อง real-time PCR ทุกยี่ห้อ ใช้ได้การทำ qPCR และ qRT-PCR รายละเอียดของน้ำยามีให้เลือกใช้เฉพาะกับเครื่อง ABI รุ่นต่างๆ และเครื่องรุ่นอื่นๆ เช่น Biorad, Corbett, MJ, Stratagene และ Esco สามารถเข้าไปดูรายละเอียดหรือคำแนะนำการใช้น้ำยาแต่ละตัวกับเครื่องยี่ห้อต่างๆได้ที่ www.invitrogen.com/qPCR

Important Parameters of Quantitative PCR (qPCR) Analysis

Exponential Phase
It is important to quantitate your qPCR at the early part of the exponential phase of amplification instead at the later cycles or at the plateau. At the beginning of the exponential phase, all reagents are still in excess. This means the low amount of product will not compete with the primers’ annealing capabilities and the DNA polymerase is still highly efficient, making your data more accurate.

Threshold Ct
The threshold for Ct determination should be set up as close as possible to the base of the exponential phase. For precise comparison, compare Ct values from different experiments with the threshold defined in the same way.

Setting the Baseline
The baseline in real-time PCR should be set up carefully to allow accurate Ct determination. The baseline should be wide enough to eliminate the background found in early cycles of amplification, but should not overlap with the area in which the amplification signal begins to rise above background. For precise comparison, compare Ct values from different experiments with the baseline defined in the same way.

R2 Value
To evaluate the performance of a primer set, analyze a serial dilution of the target (10-fold dilution for example, over 5 to 7 log). The sample can be either a gene-specific plasmid or a cDNA preparation in which the gene of interest is known to be present. R2 is the coefficient of correlation obtained for the standard curve and should be >0.99.

Standard Curve
The analysis of the standard curve gives important information. To evaluate the performance of a primer set, analyze a serial dilution of the target (e.g. 10-fold dilution for over 5 to 7 log). The sample can be either a gene-specific plasmid or a cDNA preparation in which the gene of interest is known to be present. 
 

X