PCR reaction ปริมาตร 2 ul ที่ใส่ในการทำปฏิกิริยาของ TOPO cloning สามารถมี DMSO ได้ถึง 10% หรือมี Betaine ได้ถึง 1.3 M โดยไม่ขัดขวางการทำปฏิกิริยาการทำ cloning แต่ Formamide และ Glycerol ที่มีความเข้มข้นที่สูงมากจะยับยั้งการทำปฏิกิริยาได้ (สารเหล่านี้ใช้เติมในปฏิกิริยา PCR เพื่อเพิ่ม yield ของ PCR product แต่ไม่ช่วยเพิ่มประสิทธิภาพการทำ TOPO cloning)

ไม่มีผลเพราะขนาดของ Eptiope Tag นั้นมีขนาดค่อนข้างเล็ก เช่น His (C-terminal) ขนาด 1 kDa HisG (N-terminal) ขนาด 1 kDa His-Xpress ขนาด 5 kDa Myc ขนาด 1.1 kDa Myc-His ขนาด 3 kDa V5 ขนาด 1.5 kDa V5-His ขนาด 3 kDa Xpress ขนาด 1 kDa

เพราะใน PCR4-TOPO และ PCR4Blunt-TOPO vector นั้นความยาวของ multiple cloning site (MCS) ถูกทำให้สั้นลง ดังนั้นระยะห่างระหว่าง primer ที่จะเข้าจับกับ insert จึงสั้นลง ซึ่งบริเวณที่ primer จับห่างออกไปเพียง 33 เบสจากบริเวณที่ insert แทรกอยู่ ดังนั้นทำให้ไม่ต้องอ่านเบสที่ไม่จำเป็นก่อนถึงบริเวณ insert ที่ใส่ลงไป นอกจากนั้นยังมีบริเวณ Sse8387 I ใน multicloning site ซึ่งจะก่อให้เกิด nested deletion ได้ง่ายก่อนการทำ sequencing อีกด้วย

Vector สามารถ freeze และ thaw ได้หลายครั้งโดย activity ยังคงเหมือนเดิม และ vector ยังมีอายุได้นานกว่าเมื่อเก็บที่ -20 องศาเซสเซียส แต่ vector จะมีอายุการทำงานที่สั้นถ้าเก็บไว้ที่อุณหภูมิห้องนาน 15 นาที และทำให้มีประสิทธิภาพของการ clone ที่ลดลงด้วย

สีที่ใส่ลงไปเพื่อแยกให้เห็นถึงความแตกต่างของ Vector ในแต่ละชุด kit นั้นจะไม่เกี่ยวข้องกับประสิทธิภาพของการ cloning เลย โดยสีของ vector ในแต่ละชุด kit จะมีสีดังนี้
1. TA, Zero blunt, Zero Background (vector เหล่านี้ต้องการเอนไซม์ ligase ในการ เชื่อมเข้ากับ insert) จะไม่มีสี
2. TOPO Cloning Vectors จะมีสีแดงหรือเหลืองซึ่งเกิดจากสี phenol red ที่เติมลงไป
3. Blunt TOPO vector จะมีสีฟ้าซึ่งเกิดจากการเติม Bromphenol blue ลงด้วย

แม้จะมีรายงานว่าสามารถทำการ Cloning library ด้วย TOPO ได้ผลดี แต่เราแนะนำว่าควรจะใช้ ligase ในการทำ library construction แทน TOPO เพราะจะให้ผลที่ดีกว่า สำหรับ TOPO นั้นเหมาะสำหรับการ cloning แบบง่าย ๆ ที่สามารถลดเวลาในการทำงานแต่ให้ประสิทธิภาพสูงได้อย่างไรก็ตามการเพิ่ม จำนวนโคโลนีให้มากขึ้นมีหลายวิธี เช่น
- การเพิ่มเวลาในการ incubate ให้ยาวนานขึ้น (โดยต้องเติม 6X stop buffer/salt solution ที่ให้ไว้แล้ว) อาจช่วยให้เกิดโคโลนีเพิ่มขึ้นได้ นอกจากนี้การ incubate ที่อุณหภูมิ 37 องศาเซสเซียส เป็นเวลา 4 ชั่วโมง หรือถึงข้ามคืน ก็สามารถเพิ่มประสิทธิภาพในการโคลนได้ถึง 5 เท่า
- ควรระลึกไว้เสมอว่า vector มีแนวโน้มที่จะ ligate ชิ้นส่วน DNA ที่มีขนาดเล็ก ดังนั้นควรมีการแยกชิ้นส่วน cDNA ที่มีขนาดที่ต้องการออกมาก่อน (โดยการใช้ column หรือ purify จากเจล) แล้วจึงค่อยทำการ subclone
- การ transform เข้าเซลล์โดยใช้เครื่อง electropolation นั้นจะช่วยให้ประสิทธิภาพการโคลนสูงถึง 10-20 เท่า แต่ต้องทำการตกตะกอน TOPO reaction mix เพื่อกำจัด เกลือที่ปนเปื้อนมาออกให้หมด

ชุดkit TA cloning kit จะให้ทั้ง DH5- และ Top10 F E.coli ส่วนชุด kit TOPO TA cloning kit จะให้ทั้ง TOP 10 และ TOPF E.coli สายพันธุ์ DH5- และ TOP10 จะไม่มี lacIq repressor ดังนั้น ทำให้เกิดการ expressor ของ lac promoter ได้ซึ่งไม่ต้องเติม IPTG (เป็นตัว induce) เพื่อสำหรับทำ blue-white colony E.coli strain Top10F มี lacIq repressor โดยต้องการ IPTG เป็นตัว inducer สำหรับ express ออกมาจาก lac promoter เพื่อ screen หาโคโลนีที่ต้องการด้วย blue-white screening โดยทั่วไป lacIq มีประโยชน์เมื่อถ้า insert เป็น toxic gene ควรที่จะใช้ TOP10F โดยไม่ต้องเติม IPTG โดย lacIq repressor จะกดไม่ให้ lac promoter ทำงานและจะไม่ได้โคโลนีที่เป็น blue-white แต่ยังได้โคโลนีที่อยู่บนอาหารเลี้ยงเชื้อเช่นเดิม

มีข้อได้เปรียบ 3 อย่างดังนี้
a. TOP10 cell มีการเกิด mutation ของจีน mcrA, mcrB และ mrr ซึ่งจะสามารถ encode ให้เกิด restriction system สำหรับ ดีเอ็นเอที่มี methyl group หมายถึงว่าสามารถโคลนดีเอ็นเอที่มีหมู่ methyl ที่มาจากดีเอ็นเอของ mammalian และ ดีเอ็นเอพืช โดยไม่เกิดการย่อยดีเอ็นเอนั้น
b. TOP10 cell เลี้ยงให้โตได้เร็วกว่า DH5- หลังจากเลี้ยงข้ามคืนและยังพบโคโลนีขนาดใหญ่ เมื่อใช้ TOP 10 cell
c. TOP10 cell จะให้ประสิทธิภาพในการโคลนที่สูงกว่า