Product Articles

Life Science

การศึกษา SARS-CoV-2 mutations และ gene expression profiles ด้วย Next Generation Sequencing (NGS)

         

          SARS-CoV-2 เป็น RNA virus ที่ยังมีการระบาดอย่างต่อเนื่อง และมีการเกิด mutations ได้ง่าย และหลากหลาย ซึ่งนำไปสู่การพัฒนาเป็นสายพันธุ์ต่างๆ ไม่ว่าจะเป็น เดลต้า (B.1.617.2), แกมม่า (P.1), เบต้า (B.1.351), แอลฟ่า (B.1.1.7), โอไมครอน (B.1.1.529) ซึ่งจะต้องอาศัยการทำ Whole Genome Sequencing (WGS) ด้วยการ NGS เพื่อค้นหาตำแหน่งที่เกิด mutation เพื่อระบุตำแหน่งของสารพันธุกรรมที่มีการเปลี่ยนแปลงไป

          โดย Collibri Library Prep kits ที่สามารถใช้ได้กับ Illumina Systems มีการผลิต NGS-based viral surveillance ที่มีคุณภาพสูงในการทำ sequences และร่นระยะเวลาในการทำงานลง นอกจากนี้ยังสามารถใช้ในการบ่งชี้สายพันธุ์ของไวรัส, ทำให้ทราบ gene expression profiles รวมถึงสามารถใช้ในการศึกษา target sequences เพื่อนำไปสู่การพัฒนาวัคซีน ยิ่งไปกว่านั้น Collibri ยังมีจุดเด่นที่น่าสนใจสำหรับ Viral Surveillance ดังนี้

- เพิ่มคุณภาพในการ sequencing ด้วยการติดตาม เพื่อให้เกิดการติดตามโรคระบาดได้อย่างถูกต้องแม่นยำ

- เพิ่มความแม่นยำ และความรวดเร็วของผล mRNA sequencing ที่จะได้รับด้วยการเพิ่ม adapters สำหรับ Illumina สำหรับ mRNA โดยเฉพาะ

- สามารถระบุความแตกต่างในการแสดงออกของยีนที่อาจให้ข้อมูลเชิงลึกว่าทำไมคนบางคนถึงป่วยหนักและคนอื่นไม่แสดงอาการ

การเพิ่มคุณภาพในการทำ pathogen sequences

          แม้ว่าการศึกษา full genomes ด้วยเทคนิค NGS ได้รับความนิยมเป็นอย่างมาก แต่ยังมีข้อจำกัดเรื่อง datasets ที่ยังมีความท้าทาย เนื่องจากคุณภาพในการทำ sequencing ในอดีต ซึ่ง High-quality sequences เป็นสิ่งที่จำเป็นในการติดตามโรคระบาด, ตรวจสอบการติดเชื้อไวรัสในกลุ่มประชากร, การพัฒนายาต้านไวรัส, การระบุเป้าหมายสำหรับการพัฒนาวัคซีน และความเข้าใจการเกิดปฏิสัมพันธ์ระว่างไวรัส และ host

          ซึ่งหนึ่งในทางเลือกที่จะเพิ่มคุณภาพในการ sequencing ได้ นั่นก็คือ library preparation kits ที่จะต้องถูกออกแบบมาให้สามารถจับปริมาณสารพันธุกรรมในตัวอย่างได้จำนวนมาก หลากหลาย และครอบคลุม genome ทั้งหมด โดยการเปรียบเทียบระหว่าง transposomic methods และ Invitrogen Collibri DNA Library Prep Kits สำหรับ Illumina Systems ที่สามารถครอบคลุมทั้ง pathogen และ host genomes โดยจะสังเกตได้ว่า Collibri DNA kits จะมีความเหมาะสมของ genome ทุกขนาดทั้ง pathogen, host ไปจนถึงการศึกษา genome ของ host-pathogen

 

รูปที่ 1 ความครอบคลุมของ viral genome ในการทำ sequencing

 

การเพิ่มความแม่นยำ ความรวดเร็วในการทำ RNA sequencing สำหรับการวิจัย pathogen

          ในการเพิ่มความแม่นยำของผลการทำ RNA sequencing สำหรับ RNA virus และ samples อื่นๆ Invitrogen Collibri Stranded RNA Library Prep Kits สำหรับ Illumina Systems ใช้ unique protocol ซึ่งจะช่วยให้ helper adapters ถูกติดเข้าไปโดยตรงกับ RNA ทำให้ adapter สามารถจับได้แบบ full-length adapters กับ Illumina NGS systems ในขั้นตอนที่เป็นการทำ PCR ขั้นสุดท้าย ซึ่งต่างกับ library prep kit โดยทั่วไปที่จะต้องมีการ convert RNA เป็น cDNA ก่อนเติม adapters ซึ่งจะทำให้มีความหลากหลายของ RNA transcripts นอกจากนี้ GC content ในตัวอย่างไม่ได้มีผลกระทบต่อการทำงานของ cDNA priming ใน Collibri library prep kits เนื่องจากการเชื่อม helper adapter โดยตรงกับ RNA จะช่วยเพิ่มความแม่นยำของผล NGS และ random oligonucleotide sequences จะไม่ถูกรวมเข้ากับ cDNA ทำให้ป้องกันการเกิด false SNPs และ point mutations

          Collibri Stranded RNA protocol สามารถทำได้ในระยะเวลาอันรวดเร็วเพียง 4.5 ชั่วโมงเท่านั้น และสามารถผลิต highly stranded ที่มีคุณภาพสูง ทำให้ตรวจสอบยีนที่มีการซ้อนทับกันได้ ซึ่ง protocol ดังกล่าวเหมาะสำหรับ RNA sequencing ของ genomes ทุกขนาด และยังเหมาะสมกับการศึกษา viral genomes, host gene expression และ host-pathogen interactions

 

รูปที่ 2 การต่อ helper adapters เข้าโดยตรงกับ RNA ตาม protocol ซึ่งใช้เวลาเพียง 4.5 ชั่วโมง

 

การระบุว่าเหตุใดเมื่อมีการติดเชื้อ pathogen แล้วมีลักษณะอาการแตกต่างกัน

          การวิเคราะห์ NGS ด้วย 3′ mRNA gene expression มีประสิทธิภาพในการตรวจสอบสาเหตุที่ผู้คนตอบสนองต่อเชื้อโรคในรูปแบบต่างๆ และถูกนำมาใช้เพื่อศึกษาผลกระทบของการติดเชื้อซิกา โดยการนำ Gene expression profiles ของผู้ป่วยถูกถูนำมาเปรียบเทียบกับ gene expression profiles ของผู้ติดเชื้อที่ไม่แสดงอาการจำนวนมาก จากนั้นวิเคราะห์ผล ซึ่งวิธีการดังกล่าวทำให้ผู้วิจัยประหยัดงบในการวิจัย โดยจำนวน NGS read จะต้องอยู่ระหว่าง 30–60 M read per sample หรือ 2–5 M read per sample สามารถปรับเปลี่ยนได้ตามความเหมาะสม ขึ้นอยู่กับ Illumina NGS system ที่ใช้และตำแหน่งในการ sequencing

 

รูปที่ 3 Gene expression profile ของตัวอย่างที่เป็น Zika infection ด้วยการใช้ Collibri 3ʹ mRNA Library Prep Kit สำหรับ Illumina Systems

 

ตารางสรุป NGS viral surveillance บน Illumina NGS systems


 

ข้อมูลเพิ่มเติม: http://https://www.thermofisher.com/th/en/home/life-science/sequencing/next-generation-sequencing/ngs-library-preparation-illumina-systems/collibri-applications/viral-surveillance.html

หรือติดต่อแผนก Technical support e-mail: TAS@3nholding.com หรือฝ่ายงาน Life Science product โทร 022748331

บทความโดย: ชุตินธร ช่วยวงศ์

ตำแหน่ง: Senior Technical Application Specialist for NGS and GeneArt Products


X