Product Articles

Life Science

การแก้ไขระดับ genome ด้วยการ Knock-In และติดตามโดยสี fluorescence

 

          การแก้ไขในระดับ genome หรือที่รู้จักกันดีในชื่อ CRISPR จะมีการแก้ไขอยู่ 2 รูปแบบ คือ การ knock-in โดยการเติม DNA ที่ต้องการลงในตำแหน่งบนโครโมโซมเป้าหมาย ในขณะที่ knock-out เป็นการตัด หรือกำจัด DNA ที่ไม่ต้องการออกจากโครโมโซม ซึ่งไม่ว่าจะ knock-in หรือ knock-out ล้วนจำเป็นจะต้องมีการออกแบบ guide RNA เพื่อให้ Cas9 เข้าตัดอย่างจำเพาะจากการจดจำตำแหน่ง PAM sequence ทั้งสิ้น

 

รูปที่ 1 การทำงานร่วมกันระหว่าง guide RNA และ Ca9 protein ในลักษณะ Ribonucleoprotein complex

          สำหรับการแก้ไขในระดับ genome ด้วยการ knock-in มักพบปัญหาในการออกแบบ Donor DNA ที่ใช้สำหรับการทดลองไม่ว่าจะเป็น CRISPR-Cas9 หรือ TALEN technology ทาง Invitrogen จึงมีการผลิต TrueTag Donor DNA Kit ออกมา เพื่อช่วยให้ผู้วิจัยสามารถทำงานได้ง่ายและรวดเร็วยิ่งขึ้น โดย TrueTag Donor DNA kit มีประสิทธิภาพสูงในการ editing และลดระยะเวลาในการทำงานได้อย่างมีนัยสำคัญ เมื่อเปรียบเทียบกับผลิตภัณฑ์ของแบรนด์ อื่นๆ เนื่องจากไม่ต้องผ่านการทำ cloning นอกจากนี้ TrueTag ยังเป็นผลิตภัณฑ์ที่เป็นส่วนเสริมใหม่ล่าสุดที่สามารถแก้ปัญหาการปรับเปลี่ยนลำดับพันธุกรรมระดับเซลล์ได้อย่างสมบูรณ์ที่ถูกออกแบบมาเพื่อให้ได้ผลลัพธ์ที่แม่นยำมากขึ้น และลดความยุ่งยากในการทำงานลง ในชุด kit จะประกอบด้วยน้ำยาสำหรับเตรียม donor DNA และสามารถทำตาม protocol ที่จะช่วยให้แน่ใจได้ว่าแม้แต่ผู้ใช้งานมือใหม่ก็สามารถทำงานสำเร็จได้จากสมบัติของของผลิตภัณฑ์ ดังนี้

- Up to 100% edited cells— ได้รับผลที่ยอดเยี่ยม แม้เป็นผู้ไม่มีประสบการณ์

- Eliminate cloning steps— ใช้เพียง primer เพิ่มเติมจาก reagents ที่มีในชุด kit cและได้ผลลัพธ์ ภายใน 1 ชั่วโมง

- Minimize screening time— เนื่องจากสามารถเลือกการแก้ไขในระดับเซลล์ได้ด้วยการใช้ blasticidin หรือ puromycin resistance cassettes

- Easily identify edited cells— สามารถติดตามยีนเป้าหมายบนตำแหน่ง N- หรือ C-terminus ด้วย GFP หรือ RFP

- สามารถลองออกแบบ guide RNA และ Donor DNA พร้อมคำแนะนำได้จาก https://www.thermofisher.com/th/en/home/life-science/genome-editing/geneart-crispr/invitrogen-truedesign-genome-editor.html

 

รูปที่ 2 N-Terminal Donors ที่ถูก amplify ด้วยการทำ PCR โดยใช้ forward primer

 

โดย TrueTag Donor DNA Kit ทั้ง RFPและ GFP จะต้องใช้งานร่วมกับ TrueCut Cas9 Protein v2 และ TrueGuide Synthetic gRNAs เพื่อให้เกิดการแก้ไขในระดับ genome ที่สมบูรณ์ ซึ่งสามารถใช้ได้กับ CRISPR, TALENs และ zinc-finger nucleases.

ใน TrueTag Donor DNA Kit ประกอบด้วย:

- 4 linear donor templates ได้แก่ N-terminus/puromycin resistance, N-terminus/blasticidin resistance, C-terminus/puromycin resistance และ C-terminus/blasticidin resistance

- Phusion Flash High-Fidelity PCR Master Mix

- PCR cleanup columns และ buffers

- Positive control primers ที่ใช้ในการติดตาม human beta-actin (ACTB)

 

รูปที่ 3 TrueTag knock-in ใน U2OS cells

 

          จากภาพที่ 3 U2OS cells ถูก transfect ด้วย TrueCut Cas9 v2 และ TrueTag dsDNA donor สำหรับการทำ homology directed repair (HDR) ที่มีการ insert GFP บน N-terminal หรือ C-terminal ของ ACTB และ TrueGuide gRNA  ซึ่งการ Transfection ใช้ Lipofectamine CRISPRMAX reagent จากนั้น 7 วันหลังจาก transfection ย้อมเซลล์ด้วย NucBlue Live ReadyProbes Reagent และถ่ายภาพด้วย EVOS FL Color Imaging System

 

ข้อมูลเพิ่มเติม: http://https://www.thermofisher.com/th/en/home/life-science/genome-editing/geneart-crispr/homolgy-directed-repair-knock-in.htmlTAS@3nholding.com

หรือติดต่อแผนก Technical support e-mail: TAS@3nholding.com หรือฝ่ายงาน Life Science product โทร 022748331

บทความโดย: ชุตินธร ช่วยวงศ์

ตำแหน่ง: Senior Technical Application Specialist for NGS and GeneArt Products


X