Product Articles

Life Science

ชุดเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรมจำนวนน้อยตั้งแต่ 2 pg–10 ng SuperScript™ IV Single Cell/Low Input cDNA PreAmp Kit สำหรับ NGS applications

         

          ท่านกำลังมองหาตัวช่วยเพิ่มปริมาณ cDNA จากตัวอย่าง total RNA หรือตัวอย่างที่มีจำนวนเซลล์น้อยเพื่อใช้ในการทำ Real-time PCR หรือ Next Generation Sequencing (NGS) ใช่หรือไม่ หากใช่ SuperScript™ IV Single Cell/Low Input cDNA PreAmp Kit สามารถช่วยท่านได้ จากประสิทธิภาพในการcDNA synthesis และเพิ่มจำนวนจาก single cells ตั้งแต่ 1-1,000 cell ได้โดยตรง หรือในกรณีที่มีปริมาณ total RNA น้อย ตั้งแต่ 2 pg–10 ng ก็สามารถทำได้ จุดเด่นของผลิตภัณฑ์คือมีการนำ SuperScript IV Reverse Transcriptase และ Platinum SuperFi U DNA Polymerase มาใช้ในชุดน้ำยา ทำให้ได้ yields, sensitivity และ accuracy สูง ใช้เวลาในการเตรียม reaction สั้น

 

รูปที่ 1 SuperScript™ IV Single Cell/Low Input cDNA PreAmp Kit

ข้อมูลสำคัญของผลิตภัณฑ์

• Superior sensitivity—ง่ายต่อการตรวจสอบยีนเป้าหมาย แม้จะมีจำนวนน้อย ที่ได้จาก single cell หรือ total RNA ที่มีปริมาณเพียง 2 pg

• High quality cDNA—ได้ cDNA ที่มีคุณภาพสูง เนื่องจากเป็น full-length transcript ซึ่งครอบคลุมรูปแบบ cDNA ที่ต้องการ

 

รูปที่ 2 เปรียบเทียบ cDNA yield ที่ได้จาก SuperScript IV PreAmp kit กับแบรนด์อื่น

 

• Streamlined workflow—ด้วยการใช้ one-tube protocol

• Time saving—ประหยัดเวลา เนื่องจากใช้เวลาในการ lysis และ reverse transcription สั้นลง

รูปที่ 3 Workflows และระยะเวลาการทำงานของ SuperScript IV Single Cell/ Low-Input cDNA PreAmp Kit เมื่อเปรียบเทียบกับแบรนด์อื่นๆ

 

• Universal—เป็น global preamplification ที่สามารถใช้กับ downstream analysis ในการทำ NGS (Next Generation Sequencing) หรือ real-time PCR ได้

 

รูปที่ 4 เปรียบเทียบกระบวนการและผลลัพธ์ที่ได้จากการทำ global preamplification (ซ้าย) และ target-specific preamplification (ขวา)

 

          SuperScript IV Single Cell/Low-Input cDNA PreAmp Kit มีการใช้ SMART (switching mechanism at the 5ʹ end of RNA transcript) technology โดยอาศัยสมบัติของ terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) ทำงานร่วมกับ SuperScript IV Reverse Transcriptase ด้วยการใช้ Capturing oligonucleotide ที่มีโครงสร้าง dT เป็น primer สำหรับสร้าง first strand cDNA synthesis จาก RNA ที่มีองค์ประกอบของ poly(A) เมื่อเอนไซม์ reverse transcriptase มาถึงที่ปลาย 5’ ของ RNA template TdT จะทำหน้าที่ในการเติม 1–3 nucleotides ที่มากกว่าปกติไปยังปลายของ cDNA จากนั้นจะเกิด template switching และเชื่อมเข้ากับ adapter sequence ในตำแหน่งปลาย 3’ ของ cDNA อย่างอิสระ จะสังเกตได้ว่า SuperScript IV Reverse Transcriptase มี sensitivity สูง และมีประสิทธิภาพในการเกิด template switching ส่งผลให้มีความสามารถในการจับกับ target ได้ แม้มีปริมาณน้อย

 

รูปที่ 4 Overview of SMART (switching mechanism at the 5´ end of RNA transcript) technology

 

          Adapter sequences ที่ถูกเชื่อมเข้ากับปลายทั้ง 2 ด้านของ cDNA จะคอยทำหน้าที่เป็น primer-binding sites ในขั้นตอนการทำ PCR amplification และช่วยให้ได้ full-length templates ในขั้นตอน preamplification เพื่อให้จาก Platinum SuperFi U Preamplification Master Mix ที่มีองค์ประกอบของ superior high-fidelity DNA polymerase ซึ่งช่วยเพิ่มประสิทธิภาพในการ amplification ของ long templates ที่มีความยาวสูงสุดถึง 10 kb โดยไม่มีข้อผิดพลาด

 

          กรณีที่ต้องการศึกษาในระดับ downstream ด้วยการทำ NGS cDNA ผ่านการทำ Preamplified และผ่าน purified สามาถใช้ในการเตรียม NGS library ได้ด้วยการใช้ Invitrogen™ Collibri™ ES DNA Library Prep Kit for Illumina™ Systems with UD indexes ที่สำคัญคือ SuperScript IV PreAmp kit ช่วยในการสร้าง NGS libraries ซึ่งมี low sequence bias ในการทำ RNA-seq หรือ transcriptome sequencing เนื่องจากหากมี bias จะนำไปสู่ over- หรือ under-representation ในชุดข้อมูลสำคัญ โดย biases สามารถเกิดได้จาก toward poly(dA/dT) sequences ระหว่างการเตรียม library ซึ่งเพื่อให้ครอบคลุม sequence ทั้งหมดจะต้องขยายความยาวของ RNA ที่ถูก transcription ออกไป เพื่อใช้ในการตรวจสอบ bias ของ samples preamplified โดยใช้ SuperScript IV PreAmp kit ซึ่งการ Preamplification สามารถทำได้โดยการใช้ single cells (HeLa-S3, Jurkat และ Daudi) ในการเตรียม libraries จาก cDNA ที่ได้จากการใช้ SuperScript IV PreAmp kit โดยพบว่าเกิด low bias ตลอดการ transcription ซึ่งบ่งชี้ว่าชุด SuperScript IV PreAmp สามารถทำ preamplifies transcripts ได้อย่างสม่ำเสมอจากข้อมูล scRNA-seq

รูปที่ 5 มาตรฐานการ transcription ที่ครอบคลุมชนิดของเซลล์ที่หลากหลายจากการทำ Single-cell RNA-seq โดยใช้ cDNA preamplified และ Invitrogen™ Collibri™ ES DNA Library Prep Kit ด้วย MiSeq Sequencing system

 

ข้อมูลเพิ่มเติม: https://www.thermofisher.com/th/en/home/life-science/pcr/reverse-transcription/superscript-iv-reverse-transcriptase.html

หรือติดต่อแผนก Technical support e-mail: TAS@3nholding.com หรือฝ่ายงาน Life Science product โทร 022748331

บทความโดย: ชุตินธร ช่วยวงศ์

ตำแหน่ง:Senior Technical Application Specialist for NGS and GeneArt Products


X