5 ขั้นตอนง่ายๆ สำหรับการย้อมสีโมเลกุลหรือโปรตีนภายในเซลล์ เพื่อวิเคราะห์ด้วยเทคนิค Flow Cytometry (5 Steps to Intracellular Flow Cytometry)

             Flow Cytometer เป็นเครื่องมือสำหรับใช้นับจำนวน ศึกษาลักษณะและคุณสมบัติของเซลล์ โดยใช้หลักการที่เซลล์หรืออนุภาคที่ต้องการศึกษาติดฉลากด้วยสารเรืองแสง และถูกวิเคราะห์การหักเหและการเรืองแสง โดยสัญญาณที่วัดได้จะถูกประมวลผลโดยระบบคอมพิวเตอร์ ทั้งนี้ในปัจจุบันได้มีการนำเอาเทคนิคดังกล่าวมาประยุกต์ใช้ประโยชน์ทางคลินิกและงานวิจัยในหลากหลายสาขาวิชา

               ก่อนที่จะเริ่มงานด้าน Flow cytometry จำเป็นจะต้องวางแผนการทดลองและเลือกใช้น้ำยาในขั้นตอนต่างๆ เพื่อให้เหมาะสมกับตัวอย่างและโมเลกุลที่สนใจศึกษา ซึ่งการวางแผนที่ดีจะทำให้ประหยัดต้นทุน ประหยัดเวลา รวมถึงเกิดประสิทธิภาพสูงสุดด้วย การออกแบบการทดลองดังกล่าวมีทั้งหมด 5 ขั้นตอนง่ายๆ ดังนี้

ขั้นตอนที่ 1 : การเลือกโมเลกุลที่สนใจศึกษา

เป็นการเลือกโปรตีนทั้งที่อยู่ในเซลล์หรืออยู่บริเวณผิวเซลล์ โดยใช้โมเลกุลที่เลือกเป็นตัวแทนของวัตถุประสงค์ที่ต้องการจะศึกษา ซึ่งในขั้นตอนดังกล่าวอาจจะต้องใช้การทบทวนเอกสารและงานวิจัยก่อนหน้าเพื่อใช้เป็นข้อมูลในการพิจารณาร่วมด้วย

ขั้นตอนที่ 2 : การเลือก Buffer ให้เหมาะสมกับโมเลกุลที่สนใจ

การเลือกบัฟเฟอร์ดังกล่าวจะเลือกใช้โดยพิจารณาจากตำแหน่งของโมเลกุลที่สนใจ เช่น หากต้องการย้อมสีโมเลกุลที่อยู่ภายในเซลล์จำเป็นจะต้องใช้บัฟเฟอร์สำหรับการตรึงและการสร้างคุณสมบัติการซึมผ่านของเยื่อหุ้มเซลล์ (Fixation and Permeabilization) โดยบัฟเฟอร์ที่ใช้จะถูกแบ่งตามตำแหน่งที่อยู่ของโมเลกุล ได้แก่ ใน cytoplasm, ใน nuclease หรือ โปรตีนที่มีการส่งออกไปนอกเซลล์ (secretory pathway) เช่น chemokines หรือ cytokines

ขั้นตอนที่ 3 : การออกแบบช่องสัญญาณและเลือกสีฟลูออเรสเซนส์

ในขั้นตอนนี้จะต้องยึดช่องสัญญาณของเครื่อง Flow cytometer ที่มีอยู่เป็นหลัก โดยจะต้องเลือกสีที่เครื่องสามารถตรวจวัดในช่วงความยาวคลื่นนั้น ๆ ได้ และหากมีการย้อมสีโมเลกุลหลายตัวพร้อมกัน จำเป็นจะต้องคำนึงถึงโอกาสที่สีต่างๆ จะให้ความยาวคลื่นที่ทับซ้อนกัน (Spillover) และจะเลือกใช้ชนิดของสีที่ความเข้มให้เหมาะสมกับระดับการแสดงออกของโมเลกุลแต่ละชนิดด้วย โดยผู้ใช้งานสามารถวางแผนได้เอง หรือออกแบบด้วยเครื่องมือออนไลน์ “Flow Cytometry Panel Builder” ได้ง่ายๆ เพียง 5 ขั้นตอนผ่านทางหน้าเว็บไซต์ https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-analysis/flow-cytometry/antibodies-for-flow-cytometry/flow-cytometry-panel-builder.html#brightness

ขั้นตอนที่ 4 : การใช้สีย้อมเพื่อศึกษาลักษณะทางชีวภาพ (Biology controls)

เป็นการเลือกใช้กลุ่มน้ำยาหรือสีย้อมที่เกี่ยวข้องกับการวิเคราะห์เซลล์เป็น-เซลล์ตาย เพื่อที่จะสามารถเลือกกลุ่มประชากรของเซลล์ที่มีชีวิตอยู่ และหลีกเลี่ยงกลุ่มประชากรของเศษเซลล์ สัญญาณรบกวน หรือกลุ่มประชากรที่ไม่ต้องการ ก่อนที่จะเลือกวิเคราะห์โมเลกุลที่สนใจต่อไป

ขั้นตอนที่ 5 : การใช้กลุ่มตัวอย่างควบคุมที่เกี่ยวข้องกับการทดลอง (Experimental controls)

ในกรณีที่มีการวิเคราะห์โมเลกุลที่อยู่ภายในเซลล์มากกว่า 1 ชนิด ก็จะต้องใช้แอนติบอดีที่ติดฉลากกับสีฟลูออเรสเซนส์ชนิดต่างๆ เพิ่มมากขึ้นตามจำนวนของโมเลกุลที่สนใจ ดังนั้นจำเป็นจะต้องใช้กระบวนการ compensation เพื่อตัดค่า spillover และทำให้สามารถแยกคุณลักษณะของเซลล์และแปลผลได้ถูกต้องยิ่งขึ้น ซึ่งในปัจจุบันได้มี Antibody compensation beads ที่สามารถเลือกใช้ได้ตามชนิดของแอนติบอดีที่ใช้งานกับตัวอย่างจริง จึงทำให้เตรียมตัวอย่างได้อย่างง่ายดาย และประหยัดเวลาในการตั้งค่าสำหรับขั้นตอนการทำ compensation อีกด้วย

              เพียงแค่ 5 ขั้นตอนง่ายๆ พร้อมเครื่องมือออนไลน์ที่จะช่วยให้คุณสามารถเลือกใช้สีย้อม แอนติบอดี และน้ำยาต่างๆ ให้เหมาะสมกับตัวอย่างและโมเลกุลที่ศึกษา และจะทำให้การวิเคราะห์ผลด้วยเทคนิค Flow cytometry ของคุณต่อจากนี้ง่ายดายมากยิ่งขึ้น พร้อมทั้งประหยัดต้นทุน ประหยัดเวลา รวมถึงเกิดประสิทธิภาพสูงสุดด้วย

สนใจดูข้อมูลเพิ่มเติมได้ https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-analysis/flow-cytometry/flow-cytometry-assays-reagents/intracellular-flow-cytometry.html
หรือติดต่อแผนก Technical support e-mail: TAS@3nholding.com หรือฝ่ายงาน Life Science product โทร 022748331