เทคนิคและเคล็ดลับในงาน Transfection

       การนำส่งสารพันธุกรรมเข้าสู่เซลล์หรือ Transfection นั้นสามารถทำได้หลากหลายวิธี ซึ่งหนึ่งในวิธีการที่นิยมทำกันอย่างแพร่หลายคือการใช้ lipid base transfection (liposome) เป็นตัวนำส่ง อาศัยหลักการ cationic lipids-mediated delivery ซึ่งโครงสร้างส่วนผิวของ liposome จะมีประจุบวก สามารถจับกับ phosphate backbone ของสารพันธุกรรม (DNA/RNA) และ cell membrane ของเซลล์ได้ จากนั้นจะรวมตัวเป็น liposome/nucleic acid complexes และผ่านเข้าไปในเซลล์ด้วยกระบวนการ endocytosis

              การเตรียมตัวที่ดีและเตรียมพร้อมทุกอย่างที่จำเป็นก่อนเริ่มงานด้าน Transfection จะทำให้คุณประหยัดต้นทุน ประหยัดเวลา รวมถึงเกิดประสิทธิภาพสูงสุดในการนำส่งสารพันธุกรรมเข้าสู่เซลล์ด้วย เทคนิคและเคล็ดลับที่จะนำไปสู่ความสำเร็จของการทดลองดังกล่าวสามารถทำได้ ดังนี้

1. เริ่มต้นด้วยการใช้เซลล์ที่มีสุขภาพดี โดยเตรียมเซลล์ให้พร้อมต่อการ Transfection ดังนี้

     - เซลล์ที่ใช้จะต้องมีการเพาะเลี้ยงและทำการ sub-culture ไปแล้วประมาณ 3-4 ครั้งภายหลังการนำออกมาละลายและเพาะเลี้ยง (Thaw) เพื่อให้เซลล์มีการฟื้นตัว มีอัตราการเจริญเติบโตที่เป็นปกติ และพร้อมต่อการรับสารพันธุกรรมที่จะถูกส่งเข้าไปสู่เซลล์

     - เซลล์ที่ใช้จะต้องมีอัตราของเซลล์ที่มีชีวิต (viability) อยู่มากกว่า 90%

     - หากเซลล์ที่ใช้เป็นเซลล์เพาะเลี้ยงประเภทยึดเกาะ (Adherent) จะต้องเลือกใช้น้ำยาในกลุ่ม cell dissociation reagents หรือสารที่ทำให้เซลล์ยึดเกาะหลุดออกจากภาชนะที่เพาะเลี้ยงที่มีความอ่อนโยนกับเซลล์ เช่น Gibco™ TrypLE™ เพื่อให้เซลล์ไม่เกิดการบาดเจ็บในระหว่างการ sub-culture

     - เลือกใช้เซลล์เพาะเลี้ยงที่มีอายุหรือจำนวนรอบของการ sub-culture หรือจำนวน passage numbers ที่ต่ำกว่า 30

2. วางแผนการทดลองของคุณก่อนจะทำการทดลอง

    - จะต้องศึกษาขั้นตอนในการทำ Transfection ให้เข้าใจอย่างชัดเจน เนื่องจากชนิดของเซลล์แต่ละประเภทและชนิดของสารพันธุกรรมที่จะนำเข้าสูเซลล์มีความแตกต่างกันจะใช้น้ำยาสำหรับนำส่งสารพันธุกรรมที่แตกต่างกัน รวมถึงจะต้องตรวจสอบน้ำยาและอุปกรณ์ต่างๆ ที่จำเป็นต้องใช้ รวมถึงคำนวณปริมาณน้ำยาและสารพันธุกรรมที่จะต้องใช้เพื่อให้มั่นใจว่ามีเพียงพอและพร้อมก่อนวันทำการทดลองจริง

3. ใช้ DNA หรือ สารพันธุกรรม ที่มีคุณภาพสูง

     - วัดค่าความบริสุทธิ์ของ DNA โดยการวัดอัตราส่วน OD 260/280 ให้อยู่ระหว่าง 1.7–1.9 อัตราส่วนที่สูงหรือต่ำกว่าค่าดังกล่าวจะบ่งบอกถึงสิ่งปนเปื้อนและไม่ควรใช้ในการทำ Transfection จากนั้นเจือจางด้วย DNase/RNase-free water ให้มีความเข้มข้นอยู่ที่ 0.5–1 µg/µL

4. วางแผนเลี้ยงเซลล์เพื่อให้พร้อมสำหรับการทำ Transfection

     - จะต้องเตรียมเซลล์ล่วงหน้าก่อนวันที่จะทำ Transfection และให้มีค่า % confluency อยู่ที่ 70-90% ในวันที่จะทำการ Transfection เนื่องจากความหนาแน่นของจำนวนเซลล์จะส่งผลต่อประสิทธิภาพการนำส่งสารพันธุกรรม

5. เตรียม Lipid-DNA Complexes

     - เพื่อให้เกิดประสิทธิภาพสูงสุดควรเตรียม Lipid-DNA Complexes ในอาหารเลี้ยงเซลล์ที่ลดการใช้ซีรัม เช่น Gibco™ Opti-MEM™ I Reduced Serum Medium หรือในอาหารเลี้ยงเซลล์ที่ปราศจากซีรัม

     - เจือจาง DNA และ transfection reagent ด้วยอาหาร Opti-MEM ในหลอดทดลอง 2 หลอดแยกกัน การเจือจางแบบ 2 ขั้นตอนในลักษณะนี้จะทำให้เกิดประสิทธิภาพมากกว่าการเจือจาง transfection reagent ลงใน DNA โดยตรง

     - หลังจากผสม transfection reagent ในอาหาร Opti-MEM ควรบ่มประมาณ 2-5 นาที ก่อนนำไปผสมกับ DNA ที่เจือจางในอาหาร Opti-MEM และไม่ควรบ่มเกิน 20 นาที

     - เมื่อผสม transfection reagent กับ DNA เรียบร้อยแล้วให้ปิเปตขึ้น-ลง อย่างช้าๆ ก่อนที่จะค่อยๆ เติมลงในเซลล์ที่เตรียมไว้

6. ใช้ตัวควบคุมเชิงบวก (positive control) เช่น GFP หรือ LacZ reporter plasmid เพื่อใช้สำหรับประเมินประสิทธิภาพการส่งถ่ายสารพันธุกรรม

     - ใช้กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนส์ หรือเครื่อง Flow cytometer เพื่อศึกษาการแสดงออกของ plasmid และควรตรวจวัดได้ตั้งแต่ 24-48 ชั่วโมงภายหลังการทำ transfection

         การเลือกใช้น้ำยาสำหรับงาน transfection ที่เหมาะสมและมีคุณภาพดี รวมทั้งการเตรียมพร้อมด้วยเคล็ดลับที่กล่าวมาข้างต้นจะช่วยให้คุณทำงานด้าน transfection ได้ง่ายและมีประสิทธิภาพมากยิ่งขึ้น

สนใจดูข้อมูลเพิ่มเติมได้ https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-culture.html
หรือติดต่อแผนก Technical support e-mail: TAS@3nholding.com หรือฝ่ายงาน Life Science product โทร 022748331