Exosomes & Extracellular Vesicles Detection with Flow Cytometry

     Exosomes เป็น Extracellular vesicles (EVs) ชนิดหนึ่ง ซึ่งเป็น vesicles ขนาดเล็กที่ถูกปล่อยออกมานอกเซลล์ มีความเกี่ยวข้องกับกระบวนการทางชีววิทยาของเซลล์ที่หลากหลาย ไม่ว่าจะเป็นการส่งสัญญาณระหว่างเซลล์ การขนส่งโปรตีน ไขมัน และ nucleic acids หรือแม้แต่การใช้เป็นเครื่องหมายเพื่อใช้บ่งชี้ในกระบวนการเกิดโรคต่างๆ เช่น โรคมะเร็ง เป็นต้น ด้วยคุณลักษณะของอนุภาคที่มีขนาดเล็ก มีค่าการหักเหของแสงที่ต่ำทำให้แยกหรือระบุอนุภาคได้ยากกว่าเซลล์ทั่วไป ในปัจจุบันจึงใช้เทคนิค Flow cytometry เพื่อใช้ในการนับจำนวนอนุภาคและวิเคราะห์คุณลักษณะ (phenotyping) ของ Exosomes

ข้อดีของการวิเคราะห์อนุภาค Exosomes ด้วยเทคนิค Flow cytometry

• เป็นการวิเคราะห์แบบ Single particle analysis : วิธีการวิเคราะห์แบบดั้งเดิมมีข้อจำกัดในเรื่องเวลาและต้นทุนในการวิเคราะห์ค่อนข้างสูง การใช้เทคนิค Flow cytometry จะช่วยลดเวลาในการวิเคราะห์ รวมถึงสามารถวิเคราะห์ได้แบบเซลล์ต่อเซลล์
• สามารถนับอนุภาคได้อย่างแม่นยำ
• สามารถวิเคราะห์โมเลกุลที่เกี่ยวข้องกับ Exosomes ได้หลากหลายโมเลกุลในเวลาเดียวกัน

Work Flow ในการเตรียมและวิเคราะห์ตัวอย่าง Exosomes

1. เก็บตัวอย่างจากแหล่งต่างๆ เช่น Cell culture media, Serum, Plasma, Urine หรือ Body fluids อื่นๆ
2. เตรียมตัวอย่างโดยใช้น้ำยาที่จำเพาะต่อตัวอย่างที่มาจากแหล่งต่างๆ และการใช้ ultracentrifugation
3. แยก Exosomes ออกมา โดยใช้หลักการ immunomagnetic ซึ่งเป็น beads ที่ coat ด้วย antibody ใช้สำหรับระบุ Exosomes (Antibodies-coated Dynabeads)
4. วิเคราะห์อนุภาค Exosomes ที่แยกออกมาได้ โดยใช้เทคนิคต่างๆ เช่น Immunoprecipitation หรือ Flow cytometry

Antibodies และสีย้อมที่นิยมใช้ในการวิเคราะห์อนุภาค Exosomes

Specific targets
     CD9, CD63, CD81 (cell-surface markers) are mainly used for exosomes
Membrane dyes (These stain lipids and cell membranes which is useful for EV gating and detection)
     FM lipophilic styryl dyes: FM 1-43
Intracellular dyes
     - CellTrace and CFSE dyes (intravesicular proteins)
     - Hoechst 33342 (DNA stain)

เคล็ดลับง่ายๆ ในการวิเคราะห์ Extracellular vesicles (EVs) ด้วยเทคนิค Flow cytometry

• ในการวิเคราะห์ Specific targets ที่เป็น cell-surface markers เช่น CD9, CD63 และ CD81 ควรเลือก antibody ที่ติดฉลากกับสีฟลูออเรสเซนส์ที่ให้สัญญาณสว่าง เช่น PE และ APC และไม่แนะนำให้เลือกใช้สีในกลุ่ม Tandem dyes
• เมื่อต้องการวิเคราะห์ Exosomes ใน Cell culture media เลือกใช้ Exosome-Depleted Fetal Bovine Serum ในการเลี้ยงเซลล์ ซึ่งมีการพัฒนาให้มีความจำเพาะและเหมาะสมต่องานวิจัยด้าน Exosomes (Gibco Fetal Bovine Serum, exosome-depleted: A2720801)
• กรองน้ำยาต่างๆ ที่ต้องใช้ในการวิเคราะห์ เช่น Sheath fluid หรือน้ำยาอื่นๆ ด้วย Syringe filter หรือใช้ Vacuum Filtration Systems ขนาด 0.1 µm หรือเล็กกว่า และเตรียมน้ำยาใหม่ทุกครั้ง ก่อนการวิเคราะห์ตัวอย่าง เพื่อกำจัดอนุภาคขนาดเล็กอื่นๆ ที่จะเป็นสัญญาณรบกวนในการวิเคราะห์และอ่านผล

สนใจดูข้อมูลเพิ่มเติม : 
https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-analysis/flow-cytometry/research-areas-methods-flow-cytometry/extracellular-vesicle-detection-flow-cytometry.html
หรือติดต่อแผนก Technical support e-mail: TAS@3nholding.com หรือฝ่ายงาน Life Science product โทร 022748331