5 ขั้นตอนสู่ผลลัพธ์ของ ELISA ที่เที่ยงตรง

        Enzyme-linked immunosorbent assays หรือ ELISA เป็นอีกหนึ่งเทคนิคมาตรฐานสำหรับการตรวจวิเคราะห์และวัดปริมาณของโปรตีนที่สนใจ โดยให้ผลลัพธ์ที่รวดเร็วและคงที่ จึงง่ายต่อการนำมาตรวจวิเคราะห์สำหรับงานวิจัยด้านต่างๆ โปรตีนที่มีการนำมาวิเคราะห์ด้วยเทคนิค ELISA นั้นมีหลายประเภท เช่น กลุ่มของ cytokines, chemokines, growth factors, phospho-specific targets และ immunoglobulins หรือ marker สำหรับงานทางด้าน immuno-oncology และ neurobiology เป็นต้น ซึ่งไม่ว่าโปรตีนที่ท่านสนใจจะเป็นชนิดใด ชุดน้ำยาสำหรับการทดสอบ ELISA นั้นก็สามารถทดสอบได้โดยมีหลายรูปแบบด้วยกัน ไม่ว่าจะเป็นแบบ pre-coated plates ซึ่งใน ELISA plate มีการนำ antigen หรือ antibody มาเคลือบที่พื้นผิวแล้ว, uncoated plates ซึ่งจะต้องทำการ coat antigen หรือ antibody เพื่อเคลือบพื้นที่ผิวของภาชนะก่อนทำขั้นตอนต่อไป หรือจะเป็นรูปแบบที่นักวิจัยทำการออกแบบเลือกคู่ของ antibody เองสำหรับนำมาเคลือบบนพื้นผิวหรือสำหรับนำมาใช้เพื่อเป็น detection antibody เป็นต้น ซึ่งในการทดสอบนั้นจะมีขั้นตอนรวมถึงตัวแปรที่หลากหลายจึงอาจจะทำให้บางครั้งก็ยากที่จะทำให้ได้ผลลัพธ์ที่คงที่ วันนี้จึงมี 5 ขั้นตอนหรือปัจจัยเบื้องต้น เพื่อให้ได้ผลลัพธ์ที่สม่ำเสมอและแม่นยําเมื่อทดสอบด้วยเทคนิค ELISA

ขั้นตอนที่ 1  ใช้ชุดน้ำยา ELISA จากล็อตเดียวกัน
เนื่องจากปัจจัยเรื่อง lot-to-lot variation จากชุดน้ำยา ELISA เป็นอีกหนึ่งปัจจัยที่สำคัญ โดยเฉพาะอย่างยิ่งเมื่อต้องทำโครงการวิจัยที่มีแผนงานแบบระยะยาว โดยทั่วไปผู้ผลิตจะมีการควบคุมคุณภาพเพื่อลดความแปรปรวนที่อาจจะเกิดขึ้นได้ภายในล็อตเดียวกัน การวางแผนกำหนดชุดน้ำยาและชุดอุปกรณ์ต่างๆที่จะใช้สำหรับโครงการทั้งหมดก่อนการสั่งซื้อชุดน้ำยาก็เป็นอีกหนึ่งปัจจัยที่สามารถลดความแปรปรวนของผลลงได้

ขั้นตอนที่ 2  ใช้ชุดน้ำยา ELISA แบบ pre-coated
การใช้ชุดน้ำยาแบบ pre-coated เป็นอีกหนึ่งปัจจัยที่สามารถช่วยลดความแปรปรวนได้จากการที่ชุดน้ำยาจะมีการเคลือบ antigen หรือ antibody มาแล้ว โดยผู้ผลิตจะใช้เครื่องมืออัตโนมัติในการเคลือบลงบนพื้นผิวภาชนะ ซึ่งจะลดข้อผิดพลาดจากการไปเปตของมนุษย์ลงได้ รวมถึงมีผลการทดสอบความแปรปรวนระหว่างหลุมต่อหลุม และเพลทต่อเพลทอีกด้วย ยกตัวอย่างแสดงใน ตารางที่ 1 ด้านล่างนี้

ตารางที่ 1 ค่าความแปรปรวน (CV) ของการทดสอบระหว่างเพลท (Inter-assay) และระหว่างหลุม (intra-assay) จากชุดน้ำยา Human IL-6 ELISA (Cat. No. KHC0061)

ขั้นตอนที่ 3  workflow แบบกระชับลง
การเลือกใช้ชุดน้ำยา ELISA ที่มีการออกแบบ workflow แบบย่อตามความเหมาะสม นอกจากจะช่วยลดขั้นตอนการลงมือปฏิบัติลงได้แล้วนั้น ยังมีข้อดีอื่นๆอีก เช่น

• ลดความแปรปรวนจากความผิดพลาดของมนุษย์ที่อาจจะเกิดขึ้นได้ เช่น การไปเปต หรือการเตรียม buffer
• ประหยัดเวลาในการปฏิบัติงาน
• ชุดน้ำยา ELISA จากบางผู้ผลิต จะไม่จำเป็นต้องนำ standards มาทำ serial dilutions สำหรับการสร้าง standard curve เนื่องจากทางชุดน้ำยามีมาให้พร้อมแล้ว เช่น ชุดน้ำยาในกลุ่ม Instant ELISA จากแบรนด์ Thermofisher scientific ซึ่งชุดน้ำยา Instant ELISA ได้ลดขั้นตอนลงมาเหลือเพียง 7 ขั้นตอน จากวิธีเดิม แบบ conventional ELISA ที่มีถึง 17 ขั้นตอนดังแสดงใน รูปที่ 1 นอกจากนั้นยังลดเวลาในการปฏิบัติงาน hands-on เหลือประมาณ 1 ชั่วโมงได้ โดยชุดน้ำยา Instant ELISA จากแบรนด์ Thermofisher scientific มี marker หลากหลาย ไม่ว่าจะเป็น Human IFN-γ, Human IL-6, Human IL-10 และ Human TNF-α เป็นต้น

สามารถดูรายละเอียดเพิ่มเติมได้ที่ :
https://www.thermofisher.com/th/en/home/life-science/antibodies/immunoassays/elisa-kits.html?SID=fr-elisaupdate-main

รูปที่ 1 ขั้นตอนของชุดน้ำยา Instant ELISA ที่ลดน้อยลง ช่วยให้ประหยัดเวลาและลดการแปรปรวนได้

ขั้นตอนที่ 4  การจัดการตัวอย่างอย่างเหมาะสมและมีการใช้ controls ในการทดสอบด้วย ELISA
ตัวอย่างรวมถึงวิธีการเตรียมตัวอย่างสำหรับใช้ในการทำ ELISA เป็นอีกหนึ่งปัจจัยที่สำคัญที่ต้องคำนึงเช่นกัน โดยการเตรียมตัวอย่างให้เหมาะสม มีปัจจัยและวิธีดังนี้

• หลังจากเก็บตัวอย่าง ให้นำมาใช้ทันที หรือ aliquot และเก็บแช่แข็งไว้ที่อุณหภูมิ -80 °C
• จำกัด จำนวนรอบของ freeze/thaw cycles
• เปรียบเทียบผลวิเคราะห์กับตัวอย่างที่มีรอบ freeze/thaw cycles เหมือนกัน
• ละลายตัวอย่างในน้ำแข็ง
• ขณะปฏิบัติงานเก็บตัวอย่างไว้ที่อุณหภูมิ 2-8°C
• ใช้ control ที่เหมาะสมสำหรับการทดสอบด้วย ELISA เช่น มีการทำ blank/negative controls หรือ independent positive controls

สามารถดูรายละเอียดเรื่องของการเตรียมตัวอย่างที่เหมาะสมเพิ่มเติมได้ที่ :
https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/BID/Reference-Materials/proper-sample-handling-for-immunoassays-guide.pdf

ขั้นตอนที่ 5  เพิ่มความคงที่และเที่ยงตรงของผลลัพธ์ด้วยการใช้อุปกรณ์ที่น่าเชื่อถือ
นอกจากคุณภาพของชุดน้ำยาที่กล่าวมาเบื้องต้นแล้วนั้นอุปกรณ์และเครื่องมือก็เป็นอีกปัจจัยที่ต้องคำนึงถึงเช่นกัน โดยอุปกรณ์และเครื่องมือที่นำมาใช้ในการทดสอบ ควรจะต้องเป็นอุปกรณ์ที่ได้มาตรฐาน และสามารถรับประกันผลที่เที่ยงตรงได้ อุปกรณ์และเครื่องมือที่ต้องคำนึงยกตัวอย่างเช่น เครื่องล้างปฏิกิริยาบนไมโครเพลท (microplate washer) ซึ่งจะทำให้มั่นใจได้ว่าทุกหลุมบนไมโครเพลทจะถูกล้างและแช่ด้วยบัฟเฟอร์อย่างเหมาะสม ซึ่งขั้นตอนการล้างจำเป็นจะต้องทำตามขั้นตอนการล้างทั้งหมดที่ระบุไว้ในโปรโตคอล หรืออุปกรณ์อีกอย่างที่นับว่าสำคัญก็คือ Pipettes เป็นอีกปัจจัยที่ส่งผลต่อผลการวิเคราะห์อย่างมาก จึงจำเป็นจะต้องใช้อุปกรณ์ที่มีคุณภาพ สามารถดูด-ปล่อยในปริมาณที่ถูกต้องแม่นยำ เพื่อให้ได้ผลลัพธ์ที่สม่ำเสมอและทำซ้ำได้

จากขั้นตอน 5 ขั้นตอนที่ได้กล่าวมาทั้งหมดนั้น เป็นเพียงวิธีเบื้องต้นที่จะทำให้ช่วยลดความแปรปรวนและทำให้ผลการวิเคราะห์คงที่มากยิ่งขึ้นได้ อย่างไรก็ตามก็ยังมีปัจจัยอื่นๆที่อาจส่งผลระหว่างการทดสอบด้วย ELISA ด้วยเช่นกัน หากท่านสนใจศึกษาขั้นตอนหรือโปรโตคอลสำหรับการทดสอบด้วย ELISA แบบเต็มๆนั้น สามารถอ่านรายละเอียดได้ที่ : https://www.thermofisher.com/th/en/home/life-science/antibodies/immunoassays/elisa-kits/5-steps-elisa.html หรือ https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/Application-Notes/TR0065-ELISA-guide.pdf

หากท่านสนใจข้อมูลสินค้าในกลุ่ม ELISA
สามารถติดต่อมาได้ที่แผนก Technical support e-mail: TAS@3nholding.com หรือฝ่ายงาน Life Science product โทร 022748331