การเตรียม Library สำหรับ Next-Generation Sequencing (NGS)

Library NGS คืออะไร?
    Library NGS คือชุดของ DNA ชิ้นเล็ก ๆ ที่มีขนาดใกล้เคียงกัน ที่ถูกเตรียมให้อยู่ในรูปแบบที่พร้อมสำหรับการทำลำดับเบส (sequencing) บนแพลตฟอร์ม NGS โดย DNA แต่ละชิ้นจะมีการติด Adapter sequences และอาจมี Index (ใช้ใน Multiplex) ที่บริเวณปลาย 5’ และ 3’ ซึ่ง Library หนึ่งชุดจะจำเพาะสำหรับตัวอย่างหนึ่งตัวอย่าง และสามารถรวมหลาย Library (ที่มี adapter sequence เฉพาะ) เพื่อวิเคราะห์พร้อมกันในรอบการวิเคราะห์เดียวโดยอาศัย Adapter sequences ที่แตกต่างกันในการรจำแนกแต่ละตัวอย่างได้
     Library Preparation เป็นขั้นตอนสำคัญที่มีผลต่อคุณภาพของการวิเคราะห์ลำดับเบส และความแม่นยำของผลลัพธ์ที่ได้จาก NGS ดังนั้นการเข้าใจการเตรียม Library อย่างถูกต้องจะช่วยให้ได้ผลลัพธ์ที่มีประสิทธิภาพสูงที่สุด

ขั้นตอนพื้นฐานของการเตรียม Library NGS
          การเตรียม Library ถือเป็นขั้นตอนหลักที่สำคัญต่อการทำ NGS ซึ่งจะประกอบด้วย 4 ขั้นตอนหลัก ได้แก่
          1. การตัด DNA (DNA fragmentation)
          2. การเติมการเติมอะแดปเตอร์ (Adapter sequences)
          3. การเลือกขนาดชิ้นส่วน DNA (Size Selection)
          4. การวัดปริมาณและตรวจสอบคุณภาพ Library (Library Quantification and QC)

ภาพที่ 1: ขั้นตอนการเตรียม DNA sequencing library (ref: "Preparation of DNA Sequencing Libraries" by Thermo Fisher Scientific)

1. การตัด DNA (DNA Fragmentation) เพื่อทำให้ตัวอย่าง DNA ที่เตรียมมาเป็นชิ้นเล็กๆ และมีขนาดที่เหมาะสม โดยใช้วิธีทางกายภาพหรือใช้เอนไซม์ ซึ่งตัวอย่าง Library ที่ได้จากการตัด DNA จะถูกเรียกว่า Fragment Libraries หรือหากทราบลำดับเป้าหมาย DNA ทีต้องการแล้ว สามารถเพิ่มปริมาณ DNA เป้าหมายผ่านกระบวนการ PCR เพื่อสร้าง DNA ที่มีขนาดพอดีได้ Library นี้เรียกว่า Amplicon Libraries เทคนิคการทำ DNA fragmentation สำหรับการเตรียม Library NGS
2. การเติมอะแดปเตอร์ (Addition of Adapter Sequences) อะแดปเตอร์เป็น Double-strand DNA ที่มีขนาดประมาณ 20–40 คู่เบส และมีลำดับที่ทราบแน่ชัด จะถูกเพิ่มที่ปลาย 5’ และ 3’ ของ DNA ที่ผ่านการตัดเป็นชิ้นขนาดเล็ก โดยจะทำหน้าที่ในกระบวนการวิเคราะห์ ได้แก่ การเป็นส่วนที่ให้ Primer สำหรับ sequencing มาจับ และช่วยในการจับกับพื้นผิวสำหรับการทำ Sequencing เช่น Beads หรือ Solid surface ซึ่งประกอบด้วยสาย DNA ที่สามารถเข้าคู่กับอะแดปเตอร์ได้
3. การเลือกขนาดชิ้นส่วน DNA (Size Selection) ขนาดของชิ้นส่วน DNA ที่เหมาะสมและมีผลต่อคุณภาพการวิเคราะห์ โดยทั่วไปใช้ 2 วิธีในการเลือก ได้แก่
     o การใช้เจลอิเล็กโตรโฟรีซิส (Gel Electrophoresis): เป็นการรันตัวอย่างบนเจลและเทียบกับ DNA ladder เพื่อตรวจหาขนาดชิ้นส่วน DNA ที่ต้องการ
     o การใช้ Magnetic Beads (Magnetic Bead-based Size Selection): ใช้ Magnetic Beads และสารละลายบัฟเฟอร์ที่มีความเข้มข้นต่างกันเพื่อแยกชิ้นส่วน DNA ที่มีขนาดที่ต้องการออกมา
      หมายเหตุ: หากเป็น Library Amplicon ที่ออกแบบด้วยขนาด DNA ที่เหมาะสมแล้ว อาจไม่จำเป็นต้องทำขั้นตอนนี้
4. การวัดปริมาณและตรวจสอบคุณภาพ Library (Library Quantification and QC) การวัดปริมาณ Library อย่างแม่นยำเป็นสิ่งสำคัญ เพื่อให้กระบวนการวิเคราะห์สำเร็จ มีวิธีการที่นิยมใช้ ได้แก่:
      o Bioanalyzer System: ให้ข้อมูลเกี่ยวกับความเข้มข้นและขนาดชิ้นส่วน DNA
      o qPCR: วัดเฉพาะชิ้นส่วนที่เพิ่มจำนวนได้ (Amplifiable Fragments) แม่นยำสูงแต่ไม่สามารถให้ข้อมูลขนาด DNA ได้

    และจากกระบวนการเตรียม NGS Library อาจมีความแตกต่างกันไปขึ้นอยู่กับการประยุกต์ใช้ เช่น การวิเคราะห์การแสดงออกของยีน (Gene Expression) หรือการศึกษาการเมทิลเลชันของ DNA (DNA Methylation) แต่หลักการพื้นฐานยังคงเหมือนเดิม เนื่องจากคุณภาพของ Library มีผลโดยตรงต่อความสำเร็จของกระบวนการถัดไป ตั้งแต่การเตรียมเทมเพลตไปจนถึงการทำ Sequencing ดังนั้น การเข้าใจในกระบวนการเตรียม Library จึงเป็นสิ่งสำคัญที่จะทำให้เราได้ข้อมูลการวิเคราะห์ลำดับที่มีคุณภาพสูงสุด

ศึกษาข้อมูลเพิ่มเติม: https://www.thermofisher.com/blog/behindthebench/next-generation-sequencing-library-preparation-seq-it-out-10/
หรือติดต่อแผนก Technical support e-mail: TAS@3nholding.com หรือฝ่ายงาน Life Science product โทร 02-274-8331

บทความโดย: บงกชชนก ด่านรุ่งเจริญ
ตำแหน่ง: Technical Application Specialist