เทคนิคการแยก Exosome (Exosome Isolation) เพื่อนำไปใช้ในงานวิจัย

Exosome คืออะไร ?
   เอ็กโซโซม (Exosomes) เป็นอนุภาคถุงขนาดเล็ก (extracellular vesicle) ที่มีขนาดประมาณ 30–150 นาโนเมตร โดยภายใน vesicle นั้น มักพบกรดนิวคลีอิกประเภท DNA RNA โปรตีน ไลพิด และเมแทบอไลต์ต่าง ๆ อยู่ภายใน ซึ่ง Exosome สามารถหลั่งออกจากเซลล์ที่เลี้ยงแบบ In vitro ได้ ทั้งนี้กลไกระดับโมเลกุล และองค์ประกอบของสารที่บรรจุอยู่ภายในรวมถึงหน้าที่ต่าง ๆ ยังคงอยู่ระหว่างการศึกษา ปัจจุบัน Exosome ได้รับความสนใจเพิ่มขึ้นอย่างมาก ทั้งด้านการวิจัย และการพัฒนาแนวทางในการใช้รักษาโรคในอนาคต

หน้าที่ทั่วไปของ Exosome
   หน้าที่หลักของ Exosome คือการเป็นสื่อกลางในการสื่อสารระหว่างเซลล์ทั้งในระยะใกล้และไกล โดยทำหน้าที่ลำเลียงสารต่างๆ เช่น กรดนิวคลีอิก โปรตีน ไลพิด กรดอะมิโน และเมแทบอไลต์ โดย Exosome สามารถนำไปศึกษาเพื่อให้ทราบถึงเซลล์ต้นกำเนิด (cell of origin) ได้ ปัจจุบันมีการศึกษา Exosome ในบทบาทสำคัญที่เกี่ยวข้องกับกระบวนการต่างๆ ดังนี้

     ► การสื่อสารระหว่างเซลล์
     ► การกระตุ้นการตอบสนองของระบบภูมิคุ้มกัน
     ► กระบวนการ Apoptosis
     ► การสร้างหลอดเลือดใหม่ (Angiogenesis)
     ► การอักเสบ
     ► การแพร่กระจายและพัฒนาของเนื้องอก
     ► การแข็งตัวของเลือด
     ► กระบวนการทางพยาธิสภาพที่เกี่ยวข้องกับโรคหัวใจและหลอดเลือด โรคเกี่ยวกับระบบประสาทเสื่อม และมะเร็ง

วิธีการแยก Exosome (Exosome isolation) เพื่อนำมาใช้ในงานวิจัย

การแยก Exosome ด้วยวิธีการใช้การปั่นเหวี่ยงความเร็วสูง (Ultracentrifugation)

   การแยก Exosome ด้วยวิธีการใช้การปั่นเหวี่ยงความเร็วสูง (Ultracentrifugation) ถือเป็นวิธีดั้งเดิมที่ใช้กันอย่างแพร่หลาย อย่างไรก็ตาม วิธีนี้ใช้เวลานานและอาจทำให้ Exosome เสียหายได้ เนื่องจากกระบวนการปั่นส่งผลให้ลักษณะทางกายภาพและคุณสมบัติเปลี่ยนแปลงไป นอกจากนี้ Exosome ยังสามารถแยกออกจากเซลล์และสิ่งปนเปื้อนขนาดใหญ่ได้โดยใช้เทคนิคการตกตะกอนด้วยพอลิเมอร์ (Polymer precipitation) ซึ่งทำงานโดยการจับโมเลกุลของน้ำ ส่งผลให้ความสามารถในการละลายของ Exosome ลดลงและเกิดการตกตะกอน จากนั้น Exosome ที่แยกได้จะถูกเก็บรวบรวมผ่านการปั่นเหวี่ยงที่ความเร็วต่ำ (low-speed centrifugation)

    โดยในปัจจุบันมีการใช้ชุดน้ำยาสำหรับแยก Exosome จากตัวอย่างประเภท ซีรั่ม พลาสม่า ปัสสาวะ หรือ body fluid อื่นๆ เพื่อให้ได้มาซึ่ง Exosome ที่บริสุทธ์ และนำไปวิเคราะห์ต่อด้วยวิธี Downstream (รูปที่ 1)

รูปที่ 1 การแยก Exosome โดยใช้การตกตะกอนและการปั่นเหวี่ยงที่ความเร็วต่ำ

การแยก Exosome โดยใช้ Magnetic bead (Dynabead Magnetic bead-based isolation)

   Dynabeads magnetic beads และ DynaGreen magnetic beads เป็นอีกหนึ่งวิธีสำหรับการแยกและตรวจหา Exosome ในงานวิจัยต่าง ๆ โดยอาศัยเม็ดแม่เหล็ก หรือ Magnetic bead ซึ่ง Magnetic bead เหล่านี้ช่วยให้สามารถแยก Exosome จากตัวอย่างที่หลากหลายได้ เช่น cell culture media หรือ liquid biopsy samples เป็นต้น

   หลักการทำงานของ Dynabead Magnetic bead

   สามารถแยกเป้าหมายที่เราสนใจด้วย Magnetic beads โดยใช้ผลิตภัณฑ์ Dynabeads ซึ่งมี 3 ขั้นตอนหลัก ๆ ดังนี้

1. การจับ (Bind) – Dynabeads จะจับกับเป้าหมายที่ต้องการ (เช่น เซลล์ จุลินทรีย์ก่อโรค กรดนิวคลีอิก เปปไทด์ โปรตีน หรือ Exosome) เมื่อผสมกับตัวอย่างที่สนใจ โดยอาศัยความจำเพาะของลิแกนด์บนผิวของ Dynabeads (รูปที่ 2)

รูปที่ 2

2. การล้าง (Wash) – Dynabeads สามารถยึดติดอยู่กับแท่นแม่เหล็ก และสามารถจับกับเป้าหมายที่ต้องการออกจากตัวอย่างได้อย่างรวดเร็วและมีประสิทธิภาพ จากนั้นสามารถกำจัดสิ่งที่ไม่ต้องการออกไปได้ง่าย ๆ โดยการล้างและดูดออก

3. การปลดปล่อย (Elute) – เป้าหมายที่จับกับเม็ดแม่เหล็กจะถูกปลดปล่อยออกมาในปริมาตรที่เหมาะสมสำหรับการใช้งานต่อไป

    นอกจากนี้ Dynabead ยังสามารถแยก Exosome sub-population โดยใช้ Magnetic bead ที่มีการ coat ด้วยแอนติบอดีไว้เพื่อแยก Exosome sub-population ไว้โดยเฉพาะ ได้แก่ Exosome-Human CD63 Isolation/Detection Reagent, Exosome-Human CD81 Isolation Reagent, Exosome-Human CD9 Isolation Reagent และ Exosome-Human EpCAM Isolation Reagent

  รวมถึงยังสามารถใช้ แอนติบอดีที่ติดฉลากไบโอตินสามารถใช้ร่วมกับชุด Exosome-Streptavidin Isolation/Detection Reagent และสามารถใช้แอนติบอดีประเภท IgG จากสายพันธุ์ใดก็ได้ โดยสามารถใช้ร่วมกับ Dynabead เพื่อแยก Exosome ที่ต้องการ เทคนิคนี้ตอบโจทย์เรื่องความรวดเร็ว และประสิทธิภาพ เนื่องจากใช้เวลาเพียง 40 นาทีสำหรับตัวอย่างประเภท พลาสมาและปัสสาวะ อีกทั้งยังสามารถนำ Exosome ที่แยกได้ไปวิเคราะห์ทางเทคนิค Western blot, Mass spectrometry, qPCR หรือกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน ได้ (รูปที่ 3)

รูปที่ 3 Exosome enrichment and detection.

    บริษัท กิบไทย จำกัด เป็นตัวแทนจำหน่ายสินค้ากลุ่ม Dynabead แบรนด์ Invitrogen ภายใต้ Thermo fisher scientific ที่ใช้ในการแยก Exosome เพื่อตอบโจทย์งานวิจัยของท่าน ดังนี้

1. Charge-based with Dynabeads Intact Virus Enrichment magnetic beads with release

2. Dynabeads magnetic beads for sub-population isolation:

     ✓ Exosome-Human CD63 Isolation/Detection Reagent
     ✓ Exosome-Human CD81 Isolation Reagent
     ✓ Exosome-Human CD9 Isolation Reagent
     ✓ Exosome-Human EpCAM Isolation Reagent
     ✓ DynaGreen CaptureSelect anti Anti-IgG-Fc (Multi-Species)
     ✓ Exosome-Streptavidin Isolation/Detection Reagent

3. Dynabeads magnetic beads for sub-population flow detection:

     ✓ Exosome-Human CD63 Isolation/Detection Reagent
     ✓ Exosome-Human CD81 Flow Detection Reagent
     ✓ Exosome-Human CD9 Flow Detection Reagent
     ✓ Exosome-Human EpCAM Flow Detection Reagent

4. Antibodies for western detection:

     ✓ Exosome Anti-Human CD63 antibody
     ✓ Exosome Anti-Human CD81 antibody
     ✓ Exosome Anti-Human CD9 antibody

ศึกษาข้อมูลเพิ่มเติม: thermofisher.com/dynabeads หรือติดต่อแผนก Technical Support e-mail: TAS@3nholding.com
หรือฝ่ายงาน Life Science Product โทร 02-274-8331

ผู้เขียน: ชนิษฐา ไตรรัตน์อภิบาล
ตำแหน่ง: Technical Application Specialist