เทคนิคการซ่อมแซมปลายและการเชื่อมต่ออะแดปเตอร์ของสาย DNA สำหรับการเตรียมไลบรารีในการหาลำดับสารพันธุกรรม (NGS)

        การเตรียม DNA library เป็นขั้นตอนพื้นฐานที่มีความสำคัญอย่างยิ่งในกระบวนการหาลำดับเบสด้วยเทคโนโลยี Next-Generation Sequencing (NGS) โดยเฉพาะอย่างยิ่งในขั้นตอนเริ่มต้นที่ต้องปรับโครงสร้างปลายของสาย DNA และเชื่อมต่อกับอะแดปเตอร์ (Adapter) เพื่อให้สามารถนำไปวิเคราะห์บนเครื่อง Sequencer ได้อย่างมีประสิทธิภาพ

1. การซ่อมแซมปลาย (End repair)

        หลังจากกระบวนการตัด DNA เป็นชิ้นเล็ก ๆ ตัวอย่าง DNA จะถูกนำไปผ่านกระบวนการซ่อมแซมปลาย (หรือที่เรียกว่า End Conversion) เนื่องจากชิ้นส่วน DNA ที่ได้จากการตัดด้วยแรงกลหรือเอนไซม์ที่ปลายแบบ 5′ หรือ 3′ มักมีเบสยื่นออกมา (Overhang) ซึ่งจำเป็นต้องซ่อมแซมเพื่อให้สามารถเชื่อมต่อกับ Adapter ได้ กระบวนการนี้ประกอบด้วย 3 ขั้นตอนหลัก ได้แก่ การทำให้ปลาย 3’ และ 5’ ทู่ (Blunt), การเติมหมู่ฟอสเฟต (Phosphorylation), และการเติมหมู่อะดีนีนที่ปลาย 3′ (Adenylation) ดังแสดงในภาพที่ 1

• ปลาย 5′ ที่ยื่นออกมาจะถูกเติมโดย 5′→3′ polymerase activity ของเอนไซม์ เช่น T4 DNA polymerase หรือ Klenow fragment  
• ปลาย 3′ ที่ยื่นออกมาจะถูกตัดออกโดย 3′→5′ exonuclease activity ของเอนไซม์ เช่น T4 DNA polymerase
• ปลาย 5′ ของ DNA ที่ถูกทำให้ทู่จะถูกเติมหมู่ฟอสเฟต (เพื่อเพิ่มประสิทธิภาพในการเชื่อมต่อ) โดยเอนไซม์ เช่น T4 polynucleotide kinase   

ปลาย 3′ ของ DNA ที่ถูกทำให้ทู่จะถูกเติมเบสอะดีนีน (A tailing) ซึ่งจำเป็นสำหรับการเชื่อมต่อแบบ T–A กับ Adapter โดยเอนไซม์ เช่น Klenow fragment (exo–) หรือ Taq DNA polymerase

ภาพที่ 1: กระบวนการ End Conversion
แม้ว่ากระบวนการ End Conversion จะต้องอาศัยเอนไซม์หลายชนิด แต่มีชุดน้ำยาสำเร็จรูปที่สามารถดำเนินการทุกขั้นตอนภายในหลอดเดียว ซึ่งช่วยลดระยะเวลาและการสูญเสียตัวอย่างในระหว่างการเตรียมปฏิกิริยาได้

2. การเชื่อมต่อ Adapter (Adapter ligation)

        อะแดปเตอร์ (Adapter) เป็นคู่ของ Oligonucleotide ที่จับกันเป็นสองสาย เพื่อช่วยในการเพิ่มจำนวนโคลน (Clonal Amplification) และปฏิกิริยาการหาลำดับเบส (Sequencing reaction) โดย Identical Duplex Adapter จะถูกเชื่อมต่อที่ปลายทั้งสองด้านของ DNA library เพื่อให้สามารถจับกับ Oligos บน Flow cell ในส่วนขั้นตอนเตรียม Library จะใช้ Adapter ในอัตราส่วนที่สูงกว่าปริมาณ ตัวอย่างDNA เพื่อให้ปฏิกิริยาการเชื่อมต่อเกิดขึ้นอย่างสมบูรณ์ ประสิทธิภาพของการเชื่อมต่อมีความสำคัญอย่างมากต่อการอ่านลำดับเบสบนสาย DNA fragments ซึ่งจะส่งผลโดยตรงต่ออัตราการเปลี่ยนแปลงและผลผลิตของ Library ที่ได้

ในระหว่างการสร้าง Adapter Duplex สาย Oligo 2 สายที่เรียกว่า P5 และ P7 จะจับกับ DNA fragment โดยกระบวนการ Annealing ซึ่ง P5 และ P7 adapter จะถูกตั้งชื่อตามตำแหน่งที่จับกับ Oligos บน Flow cell ปลายของ Adapter จะถูกออกแบบมาให้ไม่สามารถเข้าคู่กันเองได้ เพื่อป้องกันการจับกันเอง (Self-ligation) และมีโครงสร้างเป็นรูปตัว Y หลังจาก Annealing แล้ว อย่างไรก็ตาม โครงสร้างแบบ Y นี้จะเปลี่ยนไปหากมีการเพิ่มจำนวน Library ในขั้นตอนต่อไป (ภาพที่ 2)

ภาพที่ 2: การเชื่อมต่อ Adapter

Adapter โดยทั่วไปมีความยาวประมาณ 50–60 นิวคลีโอไทด์และประกอบด้วยส่วนสำคัญดังต่อไปนี้ (ภาพที่ 3)

ภาพที่ 3: ส่วนประกอบของ Adapter

• ตำแหน่งจับกับ P5 หรือ P7 Oligos บน Flow cell และกับ Sequencing primers
• ลำดับ Index ที่มี 6–8 นิวคลีโอไทด์ ใช้เพื่อจำแนกตัวอย่างที่แตกต่างกัน ซึ่งช่วยให้สามารถทำ Multiplex sequencing ได้ โดยทั่วไปจะใช้ Dual-indexed libraries ในการหาลำดับเบสแบบ Multiplex sequencing (ภาพที่ 4)
• การเติมหมู่ T ที่ปลาย 3′ ของ P5 Adapter เพื่อป้องกันการเกิด Adapter dimer และช่วยให้สามารถเชื่อมต่อกับปลาย 3′ A ของ Library fragment ได้ (คล้ายกับ TA cloning) นอกจากนี้หมู่ T ที่ปลาย 3′ มักจะถูกเชื่อมด้วย Phosphorothioate linkage (โดยเข้ามาแทนที่ Phosphodiester linkage) เพื่อเพิ่มความเสถียรและป้องกันการถูกย่อยโดยเอนไซม์
• การเติมหมู่ฟอสเฟตที่ปลาย 5′ ของ P7 Adapter เพื่อช่วยในการเชื่อมต่อกับปลาย 3′ ของ library fragment

สำหรับ Libraries ที่เพิ่มจำนวนด้วย PCR และ RNA-Seq libraries อาจมี Unique Molecular Identifiers (UMI) เพื่อช่วยติดตามแต่ละ Fragment และตรวจสอบความเบี่ยงเบนในระหว่างกระบวนการเพิ่มจำนวนได้

ภาพที่ 4: Multiplex sequencing โดยใช้ pooled libraries
(*ส่วนสีแดงและสีเขียวแบบทึบและมีลาย = index ที่มีลำดับเบสที่แตกต่างกัน)

        ในกระบวนการหาลำดับเบสแบบ Multiplex Sequencing ซึ่งมีการรวมตัวอย่าง DNA หลายชุดใน flow cell เดียวกันโดยการติด index ไว้เพื่อเพิ่มประสิทธิภาพและลดต้นทุนการวิเคราะห์นั้น อาจเกิดปัญหา “Index hopping” หรือการที่ลำดับ index ของตัวอย่างหนึ่งเกิดการสลับไปอยู่กับตัวอย่างอื่น ซึ่งส่งผลให้เกิดการระบุข้อมูลและการจำแนกตัวอย่างผิดพลาดและลดความแม่นยำของผลการวิเคราะห์ลงอย่างมีนัยสำคัญ โดยมักจะพบปัญหานี้เมื่อใช้เทคโนโลยี flow cell แบบ patterned ซึ่งอาศัยกระบวนการขยายสัญญาณแบบ exclusion amplification เพื่อแก้ไขปัญหาดังกล่าว มีแนวทางที่สำคัญสองประการ ได้แก่ การใช้ Unique Dual Indexes (UDI) ซึ่งเป็น index ที่ไม่ซ้ำกันในแต่ละตัวอย่าง แทนการใช้ Combinatorial Dual Indexes (CDI) และการกำจัด adapter ที่ไม่ได้เชื่อมต่อออกจาก library ตัวอย่าง ทั้งนี้การเลือกใช้วิธีการที่เหมาะสมสามารถช่วยลดอัตราการเกิด index hopping ได้อย่างมีประสิทธิภาพ ซึ่งส่งผลโดยตรงต่อความน่าเชื่อถือของข้อมูลลำดับเบสที่ได้ในงานวิจัยและการวินิจฉัยในระดับจีโนมิกส์

1. Index hopping และ Unique dual indexes

        Index hopping เป็นสถานการณ์ที่พบในกระบวนการ multiplex sequencing หรือการรวมตัวอย่าง library หลายตัวใน flow cell เดียวกัน โดย index หนึ่งอันที่ควรจับกับ library เพียงอันเดียว แต่อาจถูกสลับกับ index ของอีก library ได้ (ภาพที่ 5) ปัญหานี้มักพบใน multiplex sequencing ซึ่งมักเกิดจากหลากหบายสาเหตุ เช่น จากการปนเปื้อนของ index นอกจากนี้ index hopping มีโอกาสเกิดเพิ่มขึ้นเมื่อใช้เทคโนโลยี flow cell แบบ patterned ที่ใช้ exclusion amplification chemistry ปัญหานี้มีผลกระทบร้ายแรงต่อการวิเคราะห์ข้อมูลภายหลัง เช่น อาจทำให้การกำหนดลำดับเบสของแต่ละตัวอย่างผิดพลาด

ภาพที่ 5: Index hopping (* = mutation ที่สนใจใน library 1)

2. แนวทางหลักในการลด index hopping:

• การใช้ unique dual indexes (UDI) แทน combinatorial dual indexes (CDI) (ภาพที่ 6) โดยการกำหนด UDI เฉพาะให้กับแต่ละ library ใน sequencing pool จะช่วยให้แน่ใจว่าลำดับ index 1 และ index 2 จะถูกใช้เพียงครั้งเดียวก่อนโหลดเข้าเครื่อง sequencing
• การลดปริมาณ adapter ที่ไม่ได้เชื่อมต่อในตัวอย่าง การกำจัด adapter ที่ไม่ได้เชื่อมต่อจาก library สามารถช่วยลดปัญหา index hopping ได้ สาเหตุหนึ่งที่ PCR-free libraries มีแนวโน้มได้รับผลกระทบจาก index hopping มากกว่า library ที่ผ่านการเพิ่มจำนวนด้วย PCR เนื่องจากมีขั้นตอนทำความสะอาดที่น้อยกว่าซึ่งทำให้ adapter ที่ไม่ได้เชื่อมต่อยังคงอยู่ การวัดปริมาณ adapter ที่ไม่ได้เชื่อมต่อสามารถทำได้โดยใช้ microfluidics-based electrophoresis

ภาพที่ 6: เปรียบเทียบ combinatorial dual indexes (CDI) และ unique dual indexes (UDI)

          ด้วยเหตุนี้การซ่อมปลายสาย DNA fragments เพื่อทำการเติม adapter ที่ปลายทั้ง 2 ด้านจึงมีความสำคัญอย่างมากต่อการทำ sequencing ทั้งทำให้ Library สามารถจับกับ oligoes บน flow cell ได้, ทำให้จับกับ library primer ได้เพื่อเพิ่มจำนวน library และทำให้สามารถจำแนกแต่ละตัวอย่างได้ใน multiplex sequencing นอกจากนี้เพื่อลดปัญหา index hopping เราสามารถใช้ unique dual indexes (UDI) และการกำจัด adapter ที่ไม่ได้เชื่อมต่อเป็นกลยุทธ์สำคัญที่ช่วยเพิ่มความถูกต้องของข้อมูล sequencing ซึ่งส่งผลโดยตรงต่อคุณภาพและความน่าเชื่อถือของผลลัพธ์ที่ได้

ศึกษาข้อมูลเพิ่มเติม: https://www.thermofisher.com/th/en/home/life-science/cloning/cloning-learning-center/invitrogen-school-of-molecular-biology/next-generation-sequencing/dna-sequencing-preparation-illumina.html

หรือติดต่อแผนก Technical support e-mail: TAS@3nholding.com  
หรือฝ่ายงาน Life Science product โทร 02-274-8331                                                                           

บทความโดย: บงกชชนก ด่านรุ่งเจริญ
ตำแหน่ง: Technical Application Specialist