เทคนิคการโคลนนิ่งแบบ Gateway Cloning

     การโคลนนิ่งยีน (DNA Cloning) เป็นหนึ่งในเทคนิคสำหรับงานด้านชีววิทยาระดับโมเลกุล และการผลิตโปรตีน Recombinant ในเซลล์ต่าง ๆ โดยปกติมักเริ่มจากการตัดชิ้นดีเอ็นเอด้วย Restriction Enzyme ตามด้วยการเชื่อมต่อ (Ligation) ด้วยเอนไซม์ Ligase ซึ่งเป็นวิธีที่ใช้มานานแต่มีข้อจำกัดด้านเวลา ความแม่นยำ และความยืดหยุ่นในการเปลี่ยนเวกเตอร์

    ในปัจจุบันจึงมีระบบที่เรียกว่า Gateway Cloning เข้ามาลดการเกิดข้อจำกัดดังกล่าว ซึ่งระบบนี้ได้กลายมาเป็นทางเลือกที่น่าสนใจ เนื่องจากช่วยให้การโคลนนิ่งทำได้รวดเร็ว และแม่นยำมากขึ้น Gateway Cloning ถูกพัฒนาขึ้นโดยอาศัยระบบ Recombination ของไวรัสแลมบ์ดา (Lambda phage) ในการฝังจีโนมเข้าไปในจีโนมของแบคทีเรียหรือหากเฟจตรวจจับได้ว่าแบคทีเรียกำลังเผชิญกับความเครียดจะทำการตัดตัวเองออก (Excision) โดยใช้การแลกเปลี่ยนลำดับเฉพาะที่เรียกว่า att sites ของแบคทีเรีย การโคลนนิ่งแบบ Gateway Cloning นั้นจะใช้กลไกดังกล่าวเป็นทางเลือกแทนการโคลนนิ่งแบบใช้เอนไซม์ตัดจำเพาะ (Restriction enzyme cloning) โดยจะอาศัยการย้ายชิ้นส่วนดีเอ็นเอจากพลาสมิดหนึ่งไปยังอีกพลาสมิดหนึ่ง ซึ่งประกอบไปด้วย 2 ขั้นตอนหลัก (ภาพที่1) ดังนี้

     1) BP Reaction: รวมยีนเป้าหมาย (PCR product) เข้ากับเวกเตอร์ pDONR ผ่านการจับกันของตำแหน่ง attB กับ attP ได้เป็นเวกเตอร์ที่เรียกว่า Entry clone ที่มียีนแทรกระหว่างตำแหน่ง attL1 และ attL2

     2) LR Reaction: ย้ายยีนเป้าหมาย (PCR product) จาก Entry clone ไปยังเวกเตอร์ปลายทาง (Destination vector) โดยเอนไซม์ LR Clonase จะทำหน้าที่ส่งผ่านยีนผ่านการจับกันของตำแหน่ง attL และ attR ได้เป็น Expression clone พร้อมใช้งาน

      ทั้งสองปฏิกิริยานี้สามารถย้อนกลับกันได้ ทำให้ระบบนี้มีความยืดหยุ่นและประสิทธิภาพสูงในการโคลนนิ่งยีน

จุดเด่นของ Gateway Cloning :

• ไม่ต้องใช้ Restriction enzyme /Ligase
• ใส่ยีนเข้าทิศทางเดียวเสมอ
• สร้าง Entry clone ครั้งเดียว ใช้ได้กับเวกเตอร์หลายแบบ
• เหมาะกับงานที่ต้องโคลนนิ่งจำนวนมาก
• มีความยืดหยุ่นในการเลือก Expression Vector

ภาพที่ 1 BP Reaction สร้าง Entry Clone และ LR Reaction สร้าง Expression Clone
(https://www.snapgene.com/guides/gateway-cloning)

ทางเลือกในการสร้าง Entry Clone โดยใช้ TOPO Gateway Cloning

   TOPO Gateway Cloning คือขั้นตอนการโคลนนิ่งที่ใช้ประโยชน์จากเอนไซม์ Topoisomerase I และ Recombination site-specific ของระบบ Gateway เพื่อแทรกยีนเป้าหมายเข้าไปในเวกเตอร์ Entry Vector (pENTR) อย่างรวดเร็วโดยไม่ต้องใช้เอนไซม์ตัดและเชื่อม (Ligase) และช่วยลดขั้นตอนจากการทำ BP Reaction แบบดั้งเดิม

      ชุดน้ำยา TOPO Gateway Cloning kit ของ Invitrogen ไม่ว่าจะเป็นแบบ Directional TOPO หรือ TOPO TA cloning ช่วยให้สามารถสร้าง Entry clone ได้อย่างรวดเร็วกว่าวิธีปกติ ซึ่งเวกเตอร์นี้จะมีลำดับ attL1 และ attL2 ครอบคลุมบริเวณยีนเป้าหมาย จึงสามารถใช้ไพรเมอร์ที่มีอยู่แล้วจากการทำ PCR ได้โดยไม่ต้องออกแบบใหม่ ช่วยให้ขั้นตอนการโคลนนิ่งสะดวก ประหยัดเวลา และเหมาะสำหรับการทำงานวิจัยที่ต้องการความรวดเร็วและมีประสิทธิภาพ เช่น การสร้าง library ของยีน การศึกษาการแสดงออกของโปรตีน หรือการเตรียมพลาสมิดสำหรับการแสดงออกในระบบต่าง ๆ

ภาพที่ 2 pENTR™/D-TOPO™ Cloning Kit, with One Shot™ TOP10 Chemically Competent E. coli
รายละเอียดเพิ่มเติม : https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/K240020

ภาพที่ 3 pCRTM 8/GW/TOPOTM TA Cloning Kit with One Shot™ TOP10 E. coli
รายละเอียดเพิ่มเติม : https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/K250020?SID=srch-srp-K250020

ขั้นตอนการโคลนนิ่งด้วย TOPO Gateway Cloning

1. ใช้ PCR primer ที่มีลำดับ CACC นำหน้า Forward primer
2. ทำปฏิกิริยากับ TOPO Vector ซึ่งมีเอนไซม์ Topoisomerase I ติดไว้ที่ปลาย 3’
3. ยีนจะถูกใส่เข้าเวกเตอร์ได้อย่างรวดเร็ว
4. จากนั้นใช้ LR Clonase ย้ายยีนไปยังเวกเตอร์ปลายทางตามต้องการ

จุดเด่นของ TOPO Gateway

• ใช้เวลาน้อยกว่าการทำ BP reaction แบบปกติ
• ไม่ต้องใช้เอนไซม์เพิ่มเติม
• ได้ Entry clone ที่แม่นยำ รวดเร็ว พร้อมใช้งานต่อทันที

ตัวอย่างการประยุกต์ใช้งาน

• โคลนนิ่งยีนเพื่อแสดงออกโปรตีนใน E. coli, เซลล์สัตว์, พืช
• สร้าง Construct ที่เชื่อมกับ GFP, Tag ต่าง ๆ หรือ Reporter gene
• โคลนนิ่งยีนจำนวนมากสำหรับงาน Functional genomics
• งาน Screening ยีนแบบ High-throughput
• การวิเคราะห์การควบคุมของ Promoter

ข้อมูลเพิ่มเติม : https://www.thermofisher.com/th/en/home/life-science/cloning/gateway-cloning/gateway-technology.html
หรือติดต่อแผนก Technical Support e-mail: TAS@3nholding.com หรือฝ่ายงาน Life Science Product โทร 02-274-8331

บทความโดย: สุภิสรา ธนบัตร
ตำแหน่ง: Technical Application Specialist