วิธีการเลือกตัวควบคุมภายในสำหรับการทำ PCR แบบเรียลไทม์ (qPCR)

ความสำคัญของ ยีนควบคุมภายใน (Endogenous Control หรือ Housekeeping Gene)

     ยีนควบคุมภายใน เป็นยีนอ้างอิงที่มีการแสดงออกคงที่ ในทุกสภาวะของเซลล์ เช่น GAPDH หรือ ACTB (β-actin) ใช้เป็นตัวเปรียบเทียบในการทำ Real-time PCR (qPCR) เพื่อ ควบคุมความแปรปรวนของปริมาณ RNA หรือ cDNA ทำให้การวัดระดับการแสดงออกของยีนเป้าหมายมี ความถูกต้องและแม่นยำมากขึ้น เมื่อเปรียบเทียบระหว่างตัวอย่างต่าง ๆวิธีการวัดอัตราส่วนของการเปลี่ยนแปลงระดับการแสดงออกของยีนโดยใช้ยีนอ้างอิงในการทำ qPCR

     การทำ qPCR จะได้ผลออกมาในรูปแบบของค่า Ct (Cycle Thredhold) โดยจะใช้ค่า Ct คำนวณ ΔCt และ ΔΔCt เพื่อหาการเปลี่ยนแปลงแบบทวีคูณ (Fold change)

โดยใช้สูตร:      ΔΔCt = ΔCt_Treated− ΔCt_Control
และ          Fold Change = 2^−ΔΔCt

ตัวอย่างการคำนวณ

แทนค่า   

ΔΔCt =       3.0−5.0=−2.0
Fold Change =        2⁻⁽⁻²⁾ = 2² =4

       ดังนั้น ในการทดลองนี้ยีนเป้าหมายมีการแสดงออกเพิ่มขึ้น 4 เท่า ในตัวอย่างที่ผ่านการทดลองเมื่อเทียบกับตัวอย่างควบคุม

การเลือกยีนควบคุมที่เหมาะสม

      ยีนควบคุมภายในควรเป็นยีนที่มีการแสดงออกคงที่ในทุกสภาวะการทดลอง เพื่อให้ผลการวัดการแสดงออกของยีนเป้าหมายมีความแม่นยำ โดยค่าความแตกต่างของค่า Ct ในตัวอย่างเดียวกันไม่ควรเกิน 0.5 รอบ หากค่าต่างกันมากอาจบ่งบอกว่ายีนควบคุมนั้นไม่เหมาะสม นอกจากนี้ยีนอ้างอิงที่นิยมใช้ทั่วไป เช่น β-actin หรือ GAPDH อาจมีระดับการแสดงออกต่างกันมากในแต่ละชนิดของเนื้อเยื่อ [1] ดังนั้นควร ทดสอบความคงที่ของยีนอ้างอิงก่อนใช้งานจริง เพื่อเลือกยีนควบคุมที่เหมาะสมที่สุดสำหรับการทดลองนั้น ๆ

การทดสอบยีนควบคุมภายใน

     ในการคัดเลือกยีนควบคุมภายใน ควรทดสอบ มากกว่า 1 ยีน ภายใต้เงื่อนไขการทดลองเดียวกัน เพื่อประเมินความเสถียรของการแสดงออก จากนั้นเลือก ยีนที่มีค่าเบี่ยงเบนมาตรฐาน (SD) ต่ำที่สุด เป็นยีนควบคุมหลัก เพราะแสดงถึงความคงที่สูงสุด การใช้ ยีนควบคุมหลายตัวร่วมกัน ยังช่วยเพิ่มความถูกต้องและความน่าเชื่อถือของผลการวิเคราะห์การแสดงออกของยีนอีกด้วยเมื่อใดจึง

จำเป็นต้องใช้ตัวควบคุมภายในหลายตัวหรือไม่?

       มีงานวิจัยจำนวนมากแนะนำว่า การใช้ยีนควบคุมภายในมากกว่าหนึ่งยีน จะช่วยเพิ่มความแม่นยำของผลการวิเคราะห์การแสดงออกของยีน ตัวอย่างเช่น การศึกษาของ Schmid et al. พบว่า ในเนื้อเยื่อไตจากผู้ป่วยโรคไต[2] ยีนควบคุมบางตัวยังมีความแปรปรวนสูง จึงแนะนำให้ใช้ 18S rRNA และ Cyclophilin A ร่วมกันเพื่อให้ผลที่เชื่อถือได้มากกว่า

    ในงานวิจัยด้านมะเร็งก็เช่นกัน การใช้ยีนควบคุมหลายตัวช่วยจำแนกชนิดของเนื้องอกได้แม่นยำขึ้น ตัวอย่างเช่น Lossos et al. พบว่าการเลือกใช้ยีนควบคุมที่เหมาะสมที่สุด 2 ตัวจาก 11 ยีน[3] ทำให้การวินิจฉัยมะเร็งต่อมน้ำเหลืองชนิด non-Hodgkin มีความแม่นยำสูงขึ้น ส่วนการศึกษาของ Ayakannu et al. เกี่ยวกับมะเร็งเยื่อบุโพรงมดลูก[4] ก็เลือกใช้ยีนควบคุม 3 ตัวร่วมกันเพื่อเพิ่มความน่าเชื่อถือของผลลัพธ์

   กล่าวโดยสรุป การใช้ ยีนควบคุมภายในหลายยีน เป็นวิธีที่ช่วยลดความคลาดเคลื่อนและเพิ่มความแม่นยำของการวิเคราะห์ด้วย qPCR ได้อย่างมีประสิทธิภาพ ปัจจุบัน Thermo Fisher Scientific ได้พัฒนา TaqMan Array Human Endogenous Control Panel ซึ่งรวบรวมยีนควบคุมที่มีความเสถียรไว้ในชุดเดียว ทำให้นักวิจัยสามารถเลือกยีนอ้างอิงที่เหมาะสมได้ง่ายและสะดวกยิ่งขึ้นสำหรับการศึกษาทางชีววิทยาของมนุษย์

อ้างอิง

1. Radonic A, Thulke S, Mackay IM et al. (2004) Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR. Biochem Biophys Res Commun 313(4):856–862.
2. Schmid H, Cohen CF, Henger A et al. (2003) Validation of endogenous controls for gene expression analysis in microdissected human renal biopsies. Kidney Int 64(1):356–360.
3. Lossos IS, Czerwinski DK, Wechser MA et al. (2003) Optimization of quantitative real-time RT-PCR parameters for the study of lymphoid malignancies. Leukemia 17(4):789–795.
4. Ayakannu T, Taylor AH, Willets JM et al. (2015) Validation of endogenous control reference genes for normalizing gene expression studies in endometrial carcinoma. Mol Hum Reprod 21(9):723–735.
5. https://www.thermofisher.com/th/en/home/life-science/pcr/real-time-pcr/real-time-pcr-learning-center/gene-expression-analysis-real-time-pcr-information/choosing-endogenous-control-gene-expression-analysis-real-time-pcr.html

หรือติดต่อแผนก Technical Support e-mail: TAS@3nholding.com หรือฝ่ายงาน Life Science Product โทร 02-274-8331

บทความโดย: รวมพร สืบสกุลไพศาล
ตำแหน่ง: Technical Application Specialist