คู่มือการแก้ไขปัญหา PCR (PCR Troubleshooting Guide)

การทำ PCR เพื่อเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม (DNA amplification) มักพบปัญหาต่าง ๆ ที่ส่งผลต่อประสิทธิภาพและความถูกต้องของผลลัพธ์ โดยสามารถจำแนกปัญหาหลัก ๆ พร้อมแนวทางแก้ไขได้ดังนี้

1. ไม่ได้ผลผลิต PCR หรือไ ด้ผลผลิตน้อย

ภาพที่ 1 การรันเจลที่ไม่พบแบนของ target DNA
ที่มา: https://www.researchgate.net/publication/236012969_Optimization_of_DNA_extraction_protocol_for_DNA_isolation_from_air-dried_collection_material_for_further_phylogenetic_analysis_Coleoptera_Carabidae

สาเหตุที่พบบ่อย

• DNA คุณภาพต่ำ หรือมีปริมาณไม่เพียงพอ
• ไพรเมอร์ไม่จำเพาะกับยีนเป้าหมาย
• เอนไซม์ไม่เหมาะสมหรือเสื่อมสภาพ
• อุณหภูมิไม่เหมาะสมในแต่ละรอบ
• ความเข้มข้นของ Mg²⁺ ไม่เหมาะสม

แนวทางแก้ไข

• ตรวจสอบคุณภาพและปริมาณ DNA ก่อนทำ PCR
• ปรับความเข้มข้นของ Mg²⁺ ให้เหมาะสม
• ใช้ DNA polymerase แบบ Hot-start เช่น  Platinum™ Taq DNA Polymerase
• ปรับอุณหภูมิ annealing และจำนวนรอบ PCR ให้เหมาะกับไพรเมอร์

2.ผลผลิต PCR ไม่จำเพาะ (Non-specific) หรือมีการปนเปื้อน

ภาพที่ 2 ตัวอย่างการรันเจลที่มีการเกิด Non-specific

ที่มา: https://www.researchgate.net/publication/312199093_MPS_analysis_of_the_mtDNA_hypervariable_regions_on_the_MiSeq_with_improved_enrichment?_tp=eyJjb250ZXh0Ijp7ImZpcnN0UGFnZSI6InF1ZXN0aW9uIiwicGFnZSI6Il9kaXJlY3QifX0

สาเหตุที่พบบ่อย

• ใช้ DNA หรือไพรเมอร์เข้มข้นเกินไป
• Mg²⁺ สูงเกิน
• อุณหภูมิ annealing ต่ำเกิน

แนวทางแก้ไข

• ลดความเข้มข้นของ DNA, ไพรเมอร์ หรือ Mg²⁺
• เพิ่มอุณหภูมิ annealing เพื่อเพิ่มความจำเพาะ
• ใช้เทคนิค Touchdown PCR เพื่อเพิ่มความจำเพาะในการจับของไพรเมอร์

3. ลำดับเบสของผลิตภัณฑ์ผิดพลาด (Sequence Error)

ภาพที่ 3 ตัวอย่าง DNA ที่มีการเพิ่มปริมาณและนำไปทำ Sanger sequencing ที่ให้ผลผิดพลาด ไม่แม่นยำ และยังมีลักษณะของ Noise ค่อนข้างสูง ทำให้ผลการอ่านเบสไม่น่าเชื่อถือ

สาเหตุที่พบบ่อย

• Polymerase ความแม่นยำต่ำ
• Mg²⁺ สูงเกิน
• ปริมาณ dNTP ไม่สมดุล
• จำนวนรอบ PCR มากเกินไป
• DNA ถูกแสง UV ทำลาย

แนวทางแก้ไข

• ใช้ polymerase ที่มีความแม่นยำสูง (High-fidelity enzyme) เช่น Platinum™ PCR SuperMix High Fidelity
• ปรับความเข้มข้นของ Mg²⁺ และ dNTP ให้เหมาะสม
• ลดจำนวนรอบ PCR
• หลีกเลี่ยงการฉาย UV ใส่ DNA

ภาพที่ 4 Platinum™ PCR SuperMix High Fidelity ซึ่งเป็น DNA Polymerase ที่มีความแม่นยำสูง

4.การจัดลำดับผิดเฉพาะบริเวณปลายผลิตภัณฑ์

สาเหตุที่พบบ่อย

• ไพรเมอร์คุณภาพต่ำ หรือมีเบสซ้ำมากเกินไป
• มีนิวคลีเอสปนเปื้อน
• DNA ถูกทำลายจากแสง UV

แนวทางแก้ไข

• ใช้ไพรเมอร์ที่ผ่านการสังเคราะห์บริสุทธิ์ (Purified primers)
• หลีกเลี่ยงการฉายแสง UV นาน
• ใช้วัสดุและสารเคมีระดับ molecular-grade

5. ผลบวกเทียม (False Positive)

สาเหตุที่พบบ่อย

• ไพรเมอร์จับกันเอง (Primer-dimer)
• การปนเปื้อนของ DNA จากตัวอย่างอื่น

แนวทางแก้ไข

• ออกแบบไพรเมอร์ใหม่ให้จำเพาะกับยีนเป้าหมาย
• ใช้ master mix ที่มีระบบกำจัดการปนเปื้อน เช่น PowerUp™ SYBR™ Green Master Mix for qPCR (มี dUTP/UDG treatment)
• แยกพื้นที่การทำงาน เช่น พื้นที่เตรียมตัวอย่าง, พื้นที่ผสมปฏิกิริยา และพื้นที่รัน PCR เพื่อป้องกันการปนเปื้อน

ภาพที่ 5  PowerUp™ SYBR™ Green Master Mix for qPCR มีส่วนประกอบของ dUTP/UDG treatment ที่ช่วยลดการปนเปื้อนในระหว่างขั้นตอนการเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรมได้

สรุป

การแก้ไขปัญหา PCR ให้ได้ผลที่ถูกต้องและน่าเชื่อถือ ควรเริ่มจาก

1. ตรวจสอบคุณภาพของ DNA และไพรเมอร์
2. ควบคุมสภาวะปฏิกิริยาให้เหมาะสม
3. ใช้เอนไซม์และสารเคมีคุณภาพสูง
4. แยกพื้นที่ทำงานอย่างชัดเจน

ข้อมูลเพิ่มเติม :  https://www.thermofisher.com/th/en/home/life-science/cloning/cloning-learning-center/invitrogen-school-of-molecular-biology/pcr-education/pcr-reagents-enzymes/pcr-troubleshooting.html
หรือติดต่อแผนก Technical Support e-mail: TAS@3nholding.com หรือฝ่ายงาน Life Science Product โทร 02-274-8331

บทความโดย รวมพร สืบสกุลไพศาล
Technical Application Specialist