การเลือกเทคนิคสำหรับการเพิ่มจำนวน DNA Library ในงานเตรียม NGS

   ในเทคนิค Next Generation Sequencing (NGS) มีขั้นตอนที่สำคัญคือ จากการเพิ่มจำนวน DNA library โดยปัจจุบันวิธีการเตรียม library สามารถแบ่งได้ 2 รูปแบบคือ PCR-free และ PCR-based ทั้งนี้ ไม่ว่าจะใช้วิธีใดก็ตาม ควรปฏิบัติตามกระบวนการที่ช่วยให้ได้ library ที่มีความหลากหลายสูงและเป็น library ของตัวอย่างที่ดี แม้ว่าจะมีปริมาณเริ่มต้นที่แตกต่างกัน ซึ่งทำให้ได้ข้อมูลที่มีคุณภาพสูง

1. PCR-free libraries: การเตรียมไลบารีโดยไม่ใช้ขั้นตอนการเพิ่มจำนวนด้วยปฏิกิริยา PCR

   การเพิ่มจำนวนด้วย PCR อาจทำให้เกิด GC bias จึงมีการใช้วิธีเตรียม library แบบ PCR-free เพื่อให้ครอบคลุมบริเวณที่มี GC หรือ AT สูง และช่วยคงความหลากหลายของ library ได้ดีกว่า อย่างไรก็ตาม แม้เป็นวิธี PCR-free ก็ยังอาจเกิด bias ได้จากขั้นตอนสร้าง cluster และจากสารเคมีที่ใช้ในกระบวนการ sequencing เอง

   เมื่อเทียบกับวิธี PCR-based การเตรียม library แบบ PCR-free ต้องใช้ปริมาณ DNA เริ่มต้นมากกว่า (แม้ปัจจุบันจะมีการปรับลดปริมาณตั้งต้นลงแล้วก็ตาม) จึงอาจไม่เหมาะกับตัวอย่างที่มีจำนวนจำกัดหรือเสื่อมสภาพ นอกจากนี้การประเมินปริมาณและคุณภาพของ library ที่ได้จากวิธี PCR-free มักทำได้ยากกว่าเมื่อเทียบกับ library ที่ผ่านการเพิ่มจำนวนด้วย PCR

   อย่างไรก็ตาม PCR-free libraries ที่มีการพัฒนาให้ดีขึ้นเป็นวิธีที่เหมาะสำหรับการใช้งานต่อไปนี้:

• การศึกษาพันธุศาสตร์เชิงประชากรและพื้นฐานระดับโมเลกุลของโรค
• การวิเคราะห์โปรโมเตอร์และบริเวณควบคุมในจีโนม ซึ่งมักมี GC หรือ AT สูง
• การวิเคราะห์จีโนมทั้งตัว (Whole-genome sequencing) และการตรวจหาความแปรผัน เช่น single-nucleotide polymorphisms (SNPs) และการแทรกหรือการลบเบสขนาดเล็ก (indels)

2. PCR-based libraries: การเตรียมไลบารีโดยเพิ่มจำนวนด้วยเทคนิค PCR

   วิธี PCR-based เป็นเทคนิคที่นิยมใช้สำหรับการสร้าง NGS libraries เนื่องจากต้องการปริมาณ DNA เริ่มต้นน้อยกว่า และสามารถเพิ่มจำนวนเฉพาะชิ้นส่วน DNA ที่มีการต่อ adapters ครบทั้งสองปลายได้ อย่างไรก็ตาม กระบวนการ PCR อาจทำให้เกิด GC bias ซึ่งส่งผลกระทบต่อการวิเคราะห์ข้อมูล เช่น การทำ de novo genome assembly หรือการค้นหา SNPs อาจมีความคลาดเคลื่อนเพิ่มขึ้น

   โดย GC bias อาจเกิดได้จากหลายปัจจัย ซึ่งควรพิจารณาข้อดังต่อไปนี้เพื่อให้ได้ library ที่มีปริมาณเพียงพอและมีองค์ประกอบที่ครอบคลุมกับตัวอย่าง:

• เอนไซม์ PCR และ master mix ที่ใช้ (ภาพที่ 1)
• จำนวนรอบในการทำอุณหภูมิของ PCR และเงื่อนไขของการรัน
• สารเติมแต่งหรือสารช่วยในปฏิกิริยา PCR

ภาพที่ 1 ระดับ GC bias ที่แตกต่างกันใน library ที่เพิ่มจำนวนด้วย PCR enzyme master mix ชนิดต่างๆ

  โดยทั่วไป การเพิ่มจำนวนรอบของ PCR มากขึ้นมักเพิ่ม GC bias ดังนั้นคำแนะนำทั่วไปคือให้ใช้จำนวนรอบต่ำสุด (เช่น 4–8 รอบ) ที่ยังคงให้ปริมาณ library เพียงพอสำหรับ sequencing

   การลดจำนวนรอบ PCR ช่วยลด PCR duplicates และเพิ่มความซับซ้อนของ library โดย PCR duplicates คือการอ่านค่าที่เกิดจาก amplicons หลายตัวที่มาจาก DNA โมเลกุลเดียวกัน แม้ว่าจะมีเครื่องมือ bioinformatics สำหรับตรวจและลบ duplicates ได้ในขั้นตอนวิเคราะห์ข้อมูล แต่การลด duplicates ตั้งแต่ต้นสำคัญต่อการใช้พื้นที่บน flow cell ให้มีประสิทธิภาพที่สุด

   นอกจากนี้ยังมี PCR artifacts ที่ส่งผลต่อคุณภาพและความซับซ้อนของ library เช่น

• Amplification bias จากความไม่เสถียรของกระบวนการ PCR
• Nucleotide errors จากข้อจำกัดด้านความแม่นยำของเอนไซม์
• PCR chimeras ที่เกิดจากการเปลี่ยนแม่แบบของเอนไซม์ระหว่างการขยายสัญญาณ (ภาพที่ 2)

ภาพที่ 2 PCR artifacts ทั่วไป

    โดยสรุปการเลือกใช้วิธีเตรียม DNA library แบบ PCR-free หรือ PCR-based ขึ้นอยู่กับรูปแบบการทดลองและปริมาณ DNA เริ่มต้น

• PCR-free ลด GC bias และให้ความครอบคลุมจีโนมที่สม่ำเสมอ แต่ต้องใช้ DNA มากและประเมินคุณภาพได้ยากกว่า
• PCR-based เหมาะกับตัวอย่างที่มี DNA จำกัด แต่ต้องควบคุมจำนวนรอบ PCR และเลือกเอนไซม์ที่เหมาะสมเพื่อลด GC bias และลดการเกิด PCR artifacts

ศึกษาข้อมูลเพิ่มเติม: https://www.thermofisher.com/th/en/home/life-science/cloning/cloning-learning-center/invitrogen-school-of-molecular-biology/next-generation-sequencing/dna-sequencing-preparation-illumina.html
หรือติดต่อแผนก Technical support e-mail: TAS@3nholding.com หรือฝ่ายงาน Life Science product โทร 02-274-8331

บทความโดย: บงกชชนก ด่านรุ่งเจริญ
ตำแหน่ง: Technical Application Specialist