การประยุกต์ใช้ Digital PCR เพื่อการวิเคราะห์การแสดงออกของยีน

    การแสดงออกของยีนเป็นกระบวนการที่ครอบคลุมตั้งแต่การสร้างและส่งออก mRNA ไปจนถึงการถอดรหัสโปรตีน (Translation) และการดัดแปลงหลังการแปล ซึ่งแต่ละขั้นตอนถูกควบคุมอย่างเข้มงวด ปัจจุบันมีเทคนิคทางอณูชีววิทยาหลายชนิด เช่น Microarray, Northern blot และ PCR ที่ใช้ในการหาปริมาณ mRNA เนื่องจากให้ผลรวดเร็ว แม่นยำและยอมรับได้

   Digital PCR (dPCR) เป็นเทคโนโลยีใหม่ที่อยู่ในกลุ่มเทคนิค PCR ซึ่งช่วยเพิ่มความแม่นยำในการวิเคราะห์การแสดงออกของยีน โดยใช้หลักการแบ่งปฏิกิริยาออกเป็นหลายพันถึงหลายหมื่นปฏิกิริยาย่อยๆ และตรวจสัญญาณแบบสิ้นสุดปฏิกิริยา (End-point detection) ทำให้สามารถหาปริมาณโมเลกุลเป้าหมายได้โดยตรงด้วยสถิติปัวซอง (Poisson statistics) และรายงานผลเป็นจำนวน Copy ต่อไมโครลิตร (copy number per microliter) โดยไม่ต้องพึ่งกราฟมาตรฐาน (Standard curve)

QuantStudioTM Absolute Q dPCR

ภาพที่ 1 เครื่อง QuantStudioTM Absolute Q dPCR ซึ่งใช้กับ (A) 16 Micro Array Plate (16MAP) มีจำนวน 20,480 microchamber เพื่อแบ่งปฏิกิริยา PCR ย่อย โดย (B) วิธีหยอดตัวอย่างลงในหลุมจะต้องหยอด Isolation buffer เพื่อช่วยในการกระจายตัวอย่างลงสู่ microchamber และ (C) Gaskets ยางสำหรับปิดหลุมหยอดตัวอย่าง

ที่มา: https://www.researchgate.net/figure/Samples-loading-on-a-digital-PCR-plate-A-Right-Picture-of-a-digital-PCR-plate-and-its_fig1_359127635

   ปัจจุบัน เครื่อง dPCR ของ Applied Biosystems ได้พัฒนาให้รองรับการใช้งานร่วมกับ 16MAP Plate ซึ่งมีการแบ่งปฏิกิริยาออกเป็นปฏิกิริยาย่อย จำนวน 20,480 microchambers ช่วยป้องกันการไหลปะปนกันของแต่ละปฏิกิริยาย่อยและทำให้ขั้นตอนเตรียมตัวอย่างง่ายขึ้น

    ในการเตรียมตัวอย่าง ผู้ใช้เพียงผสมน้ำยา Master mix ที่ความเข้มข้น 1× และหยอดลงในหลุม จากนั้นเติม Isolation Buffer เพื่อช่วยลดการระเหยของตัวอย่างและช่วยให้สารผสมกระจายลงสู่ไมโครแชมเบอร์ทั้งหมดได้อย่างทั่วถึง ก่อนนำ Gasket ที่มาพร้อมเพลทมาปิดหลุมตัวอย่าง บริเวณยาง Gasket จะมีช่องสำหรับให้ระบบปั๊มของเครื่องอัดอากาศเข้าไปเพื่อกระจายตัวอย่างให้เต็มพื้นที่ของเพลท (ภาพที่ 1)

   หลังจากทำปฏิกิริยา ระบบจะนับจำนวนไมโครแชมเบอร์ที่ตรวจพบสัญญาณฟลูออเรสเซนต์ ซึ่งจะแสดงถึงการเพิ่มจำนวนของสารพันธุกรรมในแต่ละช่องปฏิกิริยาย่อย จากนั้นจึงคำนวณด้วย Poisson statistics เพื่อให้ได้ค่าปริมาณสารพันธุกรรมในรูป copy number per microliter (ภาพที่ 2)

ภาพที่ 2 PCR ดิจิทัลใช้อัตราส่วนของปฏิกิริยา PCR เชิงบวก (สีดำ) ต่อปฏิกิริยา PCR เชิงลบ (สีขาว) เพื่อนับจำนวนโมเลกุลเป้าหมาย

ที่มา: https://www.gene-quantification.de/digital.html

การศึกษาการแสดงออกของยีน

    การแสดงออกของยีน (Gene expression) คือกระบวนการที่ข้อมูลใน DNA ถูกถ่ายทอดเป็น RNA และโปรตีน กระบวนการนี้ประกอบด้วยขั้นตอนสำคัญ ได้แก่ การถอดรหัส (Transcription) ที่สร้าง mRNA จาก DNA และการแปลรหัส (Translation) ที่สร้างโปรตีนจาก mRNA ซึ่งมีบทบาทสำคัญต่อการทำงานและความสมดุลของเซลล์

ภาพที่ 3 กระบวนการแสดงออกของยีน การถ่ายทอดสารพันธุกรรมและการถอดรหัสพันธุกรรมภายในเซลล์

ที่มา: https://www.genome.gov/genetics-glossary/Gene-Expression

  การศึกษาการแสดงออกของยีนช่วยให้เข้าใจการเปลี่ยนแปลงทางชีวภาพเมื่อเซลล์เผชิญสภาวะที่ต่างกัน รวมถึงกลไกการเกิดโรค ความรุนแรง และการดื้อยาของเชื้อโรค เทคนิคที่ใช้ทั่วไป เช่น qPCR, RT-qPCR, NGS, RNA-seq และ microarray แม้จะมีประสิทธิภาพ แต่ยังมีข้อจำกัดด้านความไว (Sensitivity) และยังคงต้องสร้างกราฟเพื่อเทียบเป็นค่าอ้างอิงมาตรฐาน (Standard curve)

    ปัจจุบัน Digital PCR (dPCR) ถูกพัฒนาขึ้นเพื่อนำมาใช้เพิ่มความแม่นยำในการวัดระดับยีน โดยแบ่งสารพันธุกรรมเป็นปฏิกิริยาย่อยจำนวนมาก ทำให้ตรวจจับโมเลกุลเดี่ยวได้และให้ผลแบบ absolute quantification ที่ไม่ต้องสร้างกราฟมาตรฐาน จึงเหมาะกับยีนที่แสดงออกต่ำหรือยีนเป้าหมายที่พบเจอได้ยาก (Rare target) ในงานเชิงโมเลกุล เช่น ยีนดื้อยาและยีนก่อโรค รวมความสามารถทนต่อสารยับยั้ง PCR การใช้ dPCR จึงช่วยให้วิเคราะห์การแสดงออกของยีนได้อย่างแม่นยำ เชื่อถือได้ และตอบโจทย์งานวิจัยที่ต้องการความไวสูง

คำถามที่พบบ่อย

1) dPCR เปรียบเทียบกับวิธีอื่นๆ ในการวิเคราะห์การแสดงออกของยีน เช่น qPCR, NGS หรือ microarray อย่างไร?

   ตอบ หลักการของ dPCR คำนวณจากจำนวนปฏิกิริยาย่อยที่เกิดขึ้นบนเพลทและใช้สูตรทางสถิติ ที่สามารถได้ผลเป็นปริมาณ mRNA เป้าหมายได้ โดยไม่ต้องใช้กราฟมาตรฐาน การให้ผลที่มีความแม่นยำ และความไวสูงของ dPCR ช่วยให้สามารถหา mRNA เป้าหมายที่มีปริมาณน้อยได้อย่างน่าเชื่อถือ และตรวจจับการเปลี่ยนแปลงเพียงเล็กน้อยของปริมาณ mRNA เป้าหมายได้

2) ข้อดีของการใช้ dPCR สำหรับการวิเคราะห์การแสดงออกของยีนคืออะไร?

   ตอบ dPCR ช่วยเพิ่มความแม่นยำในการตรวจระดับการแสดงออกของยีน โดยเฉพาะในกรณีที่ยีนมีปริมาณน้อยหรือมีการเปลี่ยนแปลงเพียงเล็กน้อย ซึ่งอาจตรวจยากด้วย qPCR นอกจากนี้ยังเหมาะสำหรับใช้ยืนยันผลจาก qPCR และสามารถวิเคราะห์หลายยีนพร้อมกันได้ในปฏิกิริยาเดียวแบบ Multiplex PCR

3) ข้อดีของการใช้ dPCR กับตัวอย่างที่มีจำนวนจำกัดหรือตัวอย่างที่มีความท้าทายคืออะไร?

   ตอบ ตัวอย่างชีวภาพหรือสิ่งแวดล้อมมักมีสารยับยั้ง PCR ที่กำจัดได้ยาก ซึ่งอาจทำให้ qPCR ตรวจพบยีนเป้าหมายได้น้อยลง แต่ใน dPCR ปฏิกิริยาจะถูกแบ่งออกเป็นปฏิกิริยาย่อยจำนวนมาก ทำให้สารยับยั้งถูกเจือจางลง และเพิ่มโอกาสในการพบยีนเป้าหมาย dPCR จึงมีความทนทานต่อสารยับยั้งสูงกว่า และสามารถวัดปริมาณยีนได้แม่นยำกว่าวิธีอื่น โดยเฉพาะในตัวอย่างที่ปริมาณน้อยหรือมีความยากในการเตรียมตัวอย่าง

ศึกษาข้อมูลเพิ่มเติม:
หรือติดต่อแผนก Technical Support e-mail: TAS@3nholding.com
หรือฝ่ายงาน Life Science Product โทร 02-274-8331
ศึกษาข้อมูลเพิ่มเติม https://www.thermofisher.com/th/en/home/life-science/pcr/digital-pcr/education/basic-research/gene-expression-analysis.html#:~:text=our%20technical%20note.-,Frequently%20asked%20questions,provides%20greater%20flexibility%20for%20multiplexing

บทความโดย รวมพร สืบสกุลไพศาล
Technical Application Specialist