การเลือกใช้ Antibody ในงาน Western blotting

   Western blotting เป็นเทคนิคที่ใช้กันอย่างแพร่หลายในการตรวจสอบและยืนยันการมีอยู่ของโปรตีนที่สนใจจากตัวอย่างต่าง ๆ ไม่ว่าจะเป็น lysate จากเซลล์ เนื้อเยื่อ หรือโปรตีน recombinant โดยหัวใจสำคัญที่ทำให้ผลลัพธ์มี ความจำเพาะเจาะจง (Specificity) และ ความไว (Sensitivity) คือ การเลือกใช้แอนติบอดี (Antibody) ที่เหมาะสมกับงาน หากเลือกใช้ antibody ที่ไม่เหมาะสม อาจทำให้เกิดสัญญาณรบกวน (Background noise) หรือผลบวก/ผลลบปลอม (False positive/False negative) ได้

ประเภทของ Antibody ที่ใช้ใน Western blotting

1. Primary Antibody ทำหน้าที่จับกับโปรตีนเป้าหมายโดยตรง มีให้เลือก 2 แบบ:
   •  Monoclonal antibody: มีความจำเพาะสูง จับ Epitope เดียว เหมาะสำหรับงานที่ต้องการ ผลแม่นยำของการทำซ้ำ (Reproducibility)
   •  Polyclonal antibody: จับหลาย Epitope เหมาะกับงานที่มีปริมาณของโปรตีนน้อยหรือ มีระดับการแสดงออกต่ำ

รูปที่ 1 แสดงกลไกการจับของ primary antibody กับโปรตีนเป้าหมาย โดยอาศัย epitope-specific binding

2. Secondary Antibody ทำหน้าที่ จับกับ Primary Antibody อีกชั้นหนึ่ง ซึ่งบนตัว Secondary antibody มักถูกติดสัญญาณเอาไว้ เช่น เอนไซม์ (HRP หรือ AP) เพื่อใช้ตรวจสัญญาณแบColorimetric/Chemiluminescent/Fluorophore เพื่อให้เราตรวจหาสัญญาณได้
   •  การเลือกใช้ Secondary Antibody
       สิ่งสำคัญที่สุดคือ ต้องเลือกให้ ตรงกับชนิดสัตว์ (host species) ที่ใช้ผลิต Primary antibody เช่น
ถ้า Primary เป็น mouse IgG → ใช้ anti-mouse IgG
ถ้า Primary เป็น rabbit IgG → ใช้ anti-rabbit IgG
ถ้า Primary เป็น goat IgG → ใช้ anti-goat IgG

รูปที่ 2 แสดงหลักการใช้ Mouse anti-actin เป็น Primary antibody เพื่อจับโปรตีนเป้าหมาย (Actin) และใช้ Rabbit anti-mouse เป็น secondary antibody เพื่อจับกับ Primary antibody อีกทีหนึ่ง ซึ่งช่วยเพิ่มสัญญาณในการตรวจวัดโปรตีน

ปัจจัยสำคัญในการเลือก Antibody

1. ความจำเพาะต่อโปรตีนเป้าหมาย (Specificity)
2. พิจารณาว่า Antibody จับ Isoform หรือ Post-Translational Modification (PTM) ที่เราต้องการหรือไม่
3. ชนิดของตัวอย่าง (Sample type) เช่น เซลล์สัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม, เนื้อเยื่อพืช, จุลินทรีย์ หรือ recombinant protein
4. ตรวจสอบว่ามีการจับกับโมเลกุลอื่นที่ไม่ใช่เป้าหมายหลัก(Cross-reactivity) หรือไม่
5. เลือกใช้ให้เหมาะสมกับงานที่ต้องการศึกษา เช่น นำไปใช้ในงาน Western blotting หรือ งาน Immunofluorescent เป็นต้น
6. ชนิดของ Host species เช่น ถ้า Primary antibody ผลิตจากหนู (Mouse) → ควรเลือก Secondary ที่เป็น Anti-mouse
7. หลีกเลี่ยงการใช้ Primary จาก Species เดียวกับตัวอย่างเพื่อลดการเกิด Background
8. วิธีการตรวจสอบการจับกันระหว่างโปรตีนเป้าหมาย และ Antibody (Detection method)
   • HRP-conjugated secondary → ใช้ chemiluminescence (ECL detection)
   • Fluorescent secondary antibody → ใช้เครื่องถ่ายภาพที่สามารถตรวจสัญญาณ Fluorescence ได้
   • Biotin-labeled antibody → ใช้ Streptavidin-based detection

ข้อควรระวังและเคล็ดลับ

• เลือก Antibody ที่มีข้อมูล lot-to-lot consistency
• ใช้ Loading control antibodies (เช่น anti-β-actin, anti-GAPDH, anti-tubulin) เพื่อตรวจสอบปริมาณโปรตีนที่โหลดในแต่ละ lane
• อ่านคู่มือจาก Supplier เสมอ (เช่น Dilution factor, Blocking condition ที่เหมาะสม)
• ทดสอบ Antibody ใหม่กับ Positive control sample ก่อนใช้งานจริง

   สำหรับนักวิจัยที่สนใจผลิตภัณฑ์ Invitrogen Antibody ไม่ว่าจะเป็น β-actin antibody หรือแอนติบอดีอื่น ๆ สำหรับงาน Western blotting บริษัท กิบไทย จำกัด (Gibthai Co., Ltd.) เป็นตัวแทนจำหน่ายอย่างเป็นทางการของ Thermo Fisher Scientific ผู้ใช้งานสามารถเลือกแอนติบอดีที่ต้องการได้จากเว็บไซต์ของ Thermo Fisher Scientific โดยพิจารณาจากเกณฑ์ต่าง ๆ เช่น Protein target, Application, Target species, Host และอื่น ๆ

รูปที่ 3 ตัวอย่างหน้าเว็บไซต์ Thermo Fisher Scientific ในการเลือก antibody

ศึกษาข้อมูลเพิ่มเติม:
หรือติดต่อแผนก Technical Support e-mail: TAS@3nholding.com
หรือฝ่ายงาน Life Science Product โทร 02-274-8331
ศึกษาข้อมูลเพิ่มเติม https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/antibodies.html
ผู้เขียน: ชนิษฐา ไตรรัตน์อภิบาล (Technical Application Specialist for molecular biology products)