การเลือกแผ่นใช้เมมเบรนสำหรับงาน Western Blotting

  หลังจากแยกโปรตีนด้วยกระบวนการ SDS-PAGE ขั้นตอนสำคัญถัดไปในการทำ Western Blotting คือการถ่ายโอนโปรตีนลงบนเมมเบรน (Protein Transfer) เพื่อเตรียมพร้อมสำหรับการตรวจจับด้วยแอนติบอดี โปรตีนที่ถูกแยกตามขนาดจะถูกดึงออกจากเจลด้วยสนามไฟฟ้าและเคลื่อนที่ไปจับบนเมมเบรน ซึ่งทำหน้าที่เป็นพื้นผิวสำหรับยึดโปรตีน ขั้นตอนนี้มีผลโดยตรงต่อคุณภาพสัญญาณ ความคมชัดของแถบโปรตีน และความไวในการตรวจจับ ดังนั้น การเลือกประเภทเมมเบรนที่เหมาะสมจึงเป็นปัจจัยสำคัญต่อประสิทธิภาพของการถ่ายโอนโปรตีน

ชนิดของเมมเบรนที่ใช้ในเทคนิค Western Blotting

  ในเทคนิค Western blotting สามารถเลือกใช้เมมเบรนได้หลากหลายประเภท เช่น Nitrocellulose, PVDF, Nylon, Cellulose acetate และ Polyethersulfone (PES) โดยแต่ละชนิดมีคุณสมบัติ ข้อดี และการใช้งานที่แตกต่างกัน อย่างไรก็ตาม เมมเบรนที่ได้รับความนิยมและใช้กันอย่างแพร่หลายที่สุดคือ Nitrocellulose และ PVDF เนื่องจากให้ความไวสูง ยึดโปรตีนได้ดี และเหมาะสมกับการตรวจจับโปรตีนในช่วงความเข้มข้นต่าง ๆเมมเบรนไนโตรเซลลูโลส (Nitrocellulose membranes)
► Nitrocellulose Membrane: เมมเบรนไนโตรเซลลูโลสเป็นเมมเบรนที่ใช้กันอย่างแพร่หลายที่สุดในงาน Western blotting เนื่องจากมีคุณสมบัติที่เหมาะสมกับการตรวจจับโปรตีนหลากหลายชนิด จุดเด่นของเมมเบรนชนิดนี้ ได้แก่
    • สามารถใช้งานได้กับโปรตีนหลายช่วงขนาด
    • ไม่จำเป็นต้องทำขั้นตอน pre-wetting ก่อนใช้งาน
    • ให้สัญญาณพื้นหลังต่ำ (low background)
    • มีราคาค่อนข้างประหยัด

    ผู้ใช้สามารถเลือกขนาดรูพรุนของเมมเบรน (0.1–0.45 ไมโครเมตร) เพื่อปรับปรุงประสิทธิภาพการถ่ายโอนโปรตีนและความคมชัดของแถบโปรตีน อย่างไรก็ตาม เมมเบรนไนโตรเซลลูโลสมีความเปราะและฉีกขาดได้ง่าย จึงไม่เหมาะสำหรับการทำ Stripping และ Reprobing หลายรอบ

ภาพที่ 1 Nitrocellulose membrane

► PVDF (Polyvinylidene Fluoride) Membrane: เมมเบรน PVDF เป็นอีกหนึ่งตัวเลือกยอดนิยมสำหรับงาน Western blotting ที่ต้องการความทนทานและประสิทธิภาพสูง มีคุณสมบัติเด่นดังนี้
    • เหมาะสำหรับการตรวจจับโปรตีนหลากหลายชนิด
    • มีความสามารถในการยึดจับโปรตีนสูงกว่าเมมเบรนไนโตรเซลลูโลส
    • มีความเสถียรและทนทาน ฉีกขาดได้ยากกว่า
    • ต้องทำขั้นตอน pre-wet ก่อนใช้งาน
    • รองรับการทำ Stripping และ Reprobing ทำให้สามารถตรวจซ้ำบนเมมเบรนเดียวกันได้

   แม้เมมเบรน PVDF จะมีความทนทานและความสามารถในการยึดจับโปรตีนสูง แต่เมมเบรนชนิดนี้อาจเกิดสัญญาณพื้นหลังสูง (high background) ได้ หากขั้นตอนการบล็อกไม่สมบูรณ์ นอกจากนี้ เมมเบรน PVDF แบบมาตรฐานยังไม่เหมาะสำหรับงานตรวจแบบเรืองแสง (Fluorescent detection) เนื่องจากมักเกิดสัญญาณเรืองแสงรบกวน (autofluorescence) โดยเฉพาะในช่องสัญญาณที่มีความยาวคลื่นต่ำ เช่น UV, 488 และ 550 nm

    ทางเลือกที่เหมาะสมกว่าสำหรับงานที่ต้องใช้การตรวจเรืองแสงคือ Low Fluorescence PVDF Membrane ซึ่งถูกออกแบบเพื่อลดการเรืองแสงรบกวน และสามารถรองรับการตรวจจับได้ทั้งแบบ Colorimetric, Chemiluminescent และ Fluorescent detection

ภาพที่ 2 PVDF membrane

ตารางเปรียบเทียบระหว่างเมมเบรน Nirocellulose และ PVDF

เกณฑ์การเลือกเมมเบรน

• ขนาดโปรตีน: โปรตีนขนาดใหญ่ต้องใช้เมมเบรนที่มีรูพรุนใหญ่ (0.45 µm) เพื่อให้ถ่ายโอนไปยังเมมเบรนได้มีประสิทธิภาพ ในขณะที่โปรตีนขนาดเล็กสามารถถ่ายโอนได้ดีผ่านเมมเบรนที่มีรูพรุนเล็กกว่า (0.1–0.2 µm)
• ความชอบน้ำ/ไม่ชอบน้ำของโปรตีน: โปรตีนที่ไม่ชอบน้ำ (hydrophobic) จะยึดติดได้ดีบนเมมเบรนที่ไม่ชอบน้ำ เช่น PVDF ส่วนโปรตีนที่ชอบน้ำ (hydrophilic) จะเหมาะกับ Nitrocellulose
• ความเข้ากันได้กับวิธีตรวจสัญญาณ: Chemiluminescence detection สามารถเลือกใช้เมมเบรนได้ทั้ง Nitrocellulose, PVDF หรือ Low fluorescence PVDF ในขณะที่ Fluorescent western blot ควรเลือกใช้เมมเบรน Low fluorescence PVDF
• ปริมาณโปรตีน: สำหรับโปรตีนที่มีปริมาณน้อย ควรเลือกเมมเบรนที่มีความสามารถในการยึดจับสูง เช่น PVDF

รายละเอียดเพิ่มเติม: https://www.sigmaaldrich.com/US/en/products/protein-biology/protein-electrophoresis-and-western-blotting/transfer-membranes-and-kits
หรือติดต่อแผนก Technical Support e-mail: TAS@3nholding.com
หรือฝ่ายงาน Life Science Product โทร 02-274-8331

บทความโดย สุภิสรา ธนบัตร
Technical Application Specialist