การประยุกต์ใช้ Next-Generation Sequencing (NGS) ในการตรวจความหลากหลายของยีน HLA

     HLA (Human Leukocyte Antigen) เป็นกลุ่มยีนที่มีความหลากหลายทางพันธุกรรมสูงมากที่สุดในมนุษย์ อยู่บนโครโมโซม 6 ตำแหน่ง 6p21.3 ครอบคลุมพื้นที่ประมาณ 3.6 เมกะเบส ยีนกลุ่มนี้มีบทบาทสำคัญในการควบคุมการทำงานของระบบภูมิคุ้มกัน โดยทำหน้าที่นำเสนอแอนติเจนให้กับ T cells เพื่อกระตุ้นการตอบสนองทางภูมิคุ้มกัน แบ่งออกเป็น 2 กลุ่มหลัก คือ

• HLA class I มีบทบาทในการกระตุ้นภูมิคุ้มกันแบบเซลลูลาร์ (Cellular immunity)
• HLA class II มีบทบาทในการกระตุ้นภูมิคุ้มกันแบบสารน้ำหรือแอนติบอดี (Humoral immunity)

    การแสดงออกของยีน HLA ยังสามารถถูกกระตุ้นเพิ่มขึ้นโดย Cytokines ในระหว่างการตอบสนองของภูมิคุ้มกันทั้งแบบแต่กำเนิดและแบบจำเพาะ เนื่องจากยีน HLA มีความหลากหลายสูง ความแตกต่างของลำดับพันธุกรรมในบริเวณนี้จึงมีความสัมพันธ์กับโรคหลายชนิด โดยเฉพาะโรคภูมิคุ้มกันทำลายตนเอง (Autoimmune diseases) และโรคติดเชื้อ

         ปัจจุบัน เทคโนโลยี Next-Generation Sequencing (NGS) ช่วยให้การตรวจสอบความแปรผันของยีน HLA ทำได้อย่างละเอียด แม่นยำ และครอบคลุมมากขึ้น ส่งผลให้การวิจัย การวินิจฉัย และการแพทย์แม่นยำ (Precision medicine) มีประสิทธิภาพยิ่งขึ้น

         ในระยะแรก การค้นพบความหลากหลายของยีน HLA ทำได้โดยใช้ Alloantibody และเทคนิคทางเซรุ่มวิทยา เช่น Microlympho cytotoxicity test ซึ่งใช้ในการตรวจ tissue typing ในมนุษย์ ต่อมา เมื่อเทคโนโลยี PCR ได้รับการพัฒนา การตรวจ HLA ในระดับ DNA ก็มีความก้าวหน้าอย่างมาก ให้ความละเอียดและความแม่นยำสูงกว่าวิธีทางเซรุ่ม จนกลายเป็นเครื่องมือสำคัญในงานทางคลินิก โดยเฉพาะการตรวจสอบความเข้ากันได้ระหว่างผู้บริจาคและผู้รับการปลูกถ่าย Hematopoietic stem cell ในปัจจุบัน มีการนำเทคโนโลยี Real-time PCR เช่น (QuantStudio™ 5 Dx) มาใช้ร่วมกับ TaqMan™ Array เพื่อสามารถตรวจยีน HLA ได้หลายชนิดพร้อมกันอย่างรวดเร็วและมีประสิทธิภาพ

          หรือในส่วนของเครื่องมือ Next-Generation Sequencing (NGS) เช่น แพลตฟอร์มของ Salus Biomed ได้ยกระดับการวิเคราะห์ยีน HLA ให้เป็นแบบ High-throughput สามารถอ่านลำดับเบสของยีนเป้าหมายหลายตำแหน่งได้พร้อมกันช่วยเพิ่มความรวดเร็วและความละเอียดของผลการวิเคราะห์แม้แต่ละแพลตฟอร์ม NGS จะมีจุดเด่นแตกต่างกัน เช่น ความยาวของลำดับเบสที่อ่านได้ หรือความเร็วในการอ่าน แต่ก็ยังมีข้อจำกัดด้านค่าใช้จ่ายความซับซ้อนของกระบวนการและความจำเป็นต้องใช้ผู้เชี่ยวชาญเฉพาะทาง อย่างไรก็ตาม NGS ได้กลายเป็นเทคโนโลยีหลักในการตรวจหาความแปรผันทางพันธุกรรมในบริเวณ HLA เช่น SNP, indel และ CNV ซึ่งมีผลโดยตรงต่อความเข้ากันได้ในการปลูกถ่ายอวัยวะและเซลล์

โดยกระบวนการ NGS ทั่วไปประกอบด้วย การเพิ่มจำนวนยีนเป้าหมายด้วย PCR, การเตรียม Library โดยเชื่อม DNA กับ adapter,การทำ sequencing และการวิเคราะห์ข้อมูลด้วยซอฟต์แวร์เฉพาะทาง

         สำหรับการระบุชนิดของ HLA จากข้อมูล Whole Genome Sequencing (WGS) หรือ Whole Exome Sequencing (WES) จะนำ Sequence reads จำนวนมากไปจัดเรียงเทียบกับฐานข้อมูล IMGT/HLA ซึ่งเป็นฐานข้อมูลที่รวบรวมอัลลีล HLA ที่มีรายงานทั้งหมด จากนั้นจึงประเมินหาอัลลีลที่ตรงกันมากที่สุด โดยพิจารณาจาก

• ความแม่นยำทางสถิติของการจัดเรียงลำดับ
• ความครอบคลุมของ reads ในบริเวณเอ็กซอน (Exon)
• ความสมบูรณ์ของการครอบคลุมเอ็กซอน (Exon)

ภาพที่ 1 ภาพรวมการวิเคราะห์ข้อมูลสำหรับการตรวจหาชนิดของ HLA โดยใช้ WGS/WES
(อ้างอิงจาก https://www.nature.com/articles/jhg2015102)

       NGS สำหรับการตรวจ HLA ใช้หลักๆ 2 วิธีคือ Long-range PCR และ Hybrid capture โดยปัจจุบันการผสาน Long-read sequencing กับ Bioinformatics ช่วยให้วิเคราะห์ HLA ได้แม่นยำถึงระดับ Fourth field และระบุ Haplotype ได้ชัดเจน การหาลำดับทั้งยีนเหมาะกับการสร้างฐานข้อมูลประชากร ส่วนการตรวจเฉพาะยีนหรือ Exon เพียงพอสำหรับงานคลินิก นอกจากนี้ NGS ยังช่วยเปิดมุมมอง HLA-omics และความเข้าใจโรคภูมิคุ้มกันได้ลึกยิ่งขึ้น

ศึกษาข้อมูลเพิ่มเติม:

Kishore A, Petrek M. Next-generation sequencing based HLA typing: deciphering immunogenetic aspects of sarcoidosis. Frontiers in genetics. 2018 Oct 25;9:503.

หรือติดต่อแผนก Technical support e-mail: TAS@3nholding.com หรือฝ่ายงาน Life Science product โทร 02-274-8331

บทความโดย: บงกชชนก ด่านรุ่งเจริญ
ตำแหน่ง: Technical Application Specialist