เคล็ดลับสกัด RNA ให้ได้ทั้งคุณภาพและปริมาณ

       การสกัด RNA เป็นขั้นตอนพื้นฐานที่สำคัญมากในงานด้านอณูชีววิทยา เนื่องจาก RNA เป็นสารที่เสื่อมสภาพได้ง่าย การได้ RNA ปริมาณน้อยหรือมีการเสื่อมสภาพจึงเป็นปัญหาที่พบได้บ่อย อย่างไรก็ตาม RNA คุณภาพสูงมีความจำเป็นอย่างยิ่งสำหรับการนำไปใช้งานต่อ เช่น NGS, qRT-PCR และการสังเคราะห์ cDNA หากใช้ RNA ที่มีคุณภาพต่ำ อาจส่งผลให้ผลการวิเคราะห์คลาดเคลื่อนหรือไม่น่าเชื่อถือได้

       ปัญหาเหล่านี้สามารถลดหรือหลีกเลี่ยงได้ หากเลือกใช้เทคนิคการสกัดที่เหมาะสม โดยมีข้อแนะนำสำคัญดังนี้

1. การเลือกชุดสกัด RNA ที่เหมาะสม
       เนื่องจากในท้องตลาดมีชุดสกัดและสารเคมีสำหรับการสกัด RNA มากมาย แต่บางวิธีอาจมีความเหมาะสมกับเป้าหมายไม่เท่ากัน จึงควรศึกษาข้อมูลของแต่ละชุดหรือสารเคมีอย่างรอบคอบ และพิจารณาปัจจัยต่างๆ เช่น ประเภทของตัวอย่างที่ใช้ในการสกัด RNA, ปริมาณเริ่มต้นของตัวอย่าง, การนำ RNA ไปใช้งานในขั้นตอนถัดไป, ปริมาณงานที่ต้องการ (Throughput) และชนิดของ RNA ที่ต้องการวิเคราะห์

       ยกตัวอย่างเช่น หากต้องการสกัด RNA ทั้งหมด (Total RNA) มีตัวอย่างจำนวนน้อย และต้องการใช้วิธีมาตรฐานที่ได้รับการยอมรับอย่างกว้างขวางเพื่อให้ได้ RNA คุณภาพสูง อาจเลือกใช้ TRIzol reagent ในการสกัด หรือหากต้องการสกัด small RNA อาจเลือกใช้ชุดสกัดแบบ column-based เช่น mirVana™ miRNA Isolation Kit เป็นต้น

รูปที่ 1 TRIzol reagent (ซ้าย) และชุดสกัด mirVana™ miRNA Isolation Kit (ขวา)

2. ปริมาณตัวอย่างตั้งต้น
       ชุดสกัด RNA และสารเคมีส่วนใหญ่จะมีคำแนะนำเกี่ยวกับปริมาณตัวอย่างเริ่มต้นที่เหมาะสมสำหรับแต่ละประเภทของตัวอย่าง หากใส่มากเกินกว่าที่แนะนำ อาจรบกวนขั้นตอนการสลายเซลล์ (Lysis) หรือการแยก RNA ออกจากส่วนประกอบอื่นในเซลล์ได้อย่างมีประสิทธิภาพ สำหรับวิธีสกัด RNA แบบColumn-based นั้นหากใส่ปริมาณตัวอย่างเริ่มต้นมากเกินไป อาจทำให้ความสามารถในการจับของคอลัมน์ ลดลงซึ่งส่งผลให้ปริมาณ RNA ที่ได้ลดลงตามไปด้วย นอกจากนี้ปริมาณ RNA ในเนื้อเยื่อของสัตว์แต่ละชนิดอาจแตกต่างกัน เช่น เซลล์หัวใจและกล้ามเนื้อจะมี RNA โดยรวมค่อนข้างน้อย เมื่อเทียบกับเซลล์ในม้ามและต่อมไธมัสซึ่งมีกรดนิวคลีอิกจำนวนมาก หรือเนื้อเยื่อบางชนิดอาจมีปัจจัยแทรกซ้อนเพิ่มเติมที่ส่งผลต่อการสกัด จึงอาจต้องมีการปรับเปลี่ยนขั้นตอนการสกัดเพื่อให้สามารถสกัด RNA คุณภาพสูงได้

3. เตรียมสภาพแวดล้อมสำหรับการสกัดให้ปราศจาก RNase
       RNase เป็นสาเหตุหลักของการเสื่อมสภาพของ RNAโดย RNase ในกลุ่ม RNase A มีโครงสร้างที่เสถียรจากพันธะไดซัลไฟด์หลายตำแหน่ง ทำให้มีความเสถียรสามารถคงกิจกรรมของเอนไซม์ได้แม้ถูกทำลายโครงสร้างด้วยความร้อนหรือสารเคมี 

       ดังนั้น เพื่อหลีกเลี่ยงการปนเปื้อน RNase ในระหว่างการสกัด RNA ควรกำหนดพื้นที่ทำงานให้ปราศจาก RNase เช่น การกำหนดพื้นที่บนโต๊ะทดลองเฉพาะส่วนหนึ่งด้วยเทปกั้น แยกออกจากพื้นที่ที่ใช้สกัด DNA หรือโปรตีน ซึ่งพื้นที่นี้ควรมีเฉพาะสารเคมี อุปกรณ์ใช้แล้วทิ้ง ปิเปต และถุงมือที่ใช้เฉพาะสำหรับการทำงานกับ RNA เท่านั้น

4. สวมอุปกรณ์ป้องกันส่วนบุคคล (PPE)
       เหงื่อและน้ำมันบนผิวหนังเป็นแหล่งปนเปื้อน RNase ดังนั้นการสวมถุงมือจึงเป็นสิ่งสำคัญอย่างยิ่งเพื่อป้องกันการปนเปื้อนจากมือ และหากใช้ถุงมือที่สวมอยู่ไปสัมผัสพื้นผิวที่อาจมี RNase ปนเปื้อนอยู่ เช่น ลูกบิดประตู ใบหน้า หรือพื้นผิวอื่นๆ ที่อยู่นอกเขตปลอด RNase ควรเปลี่ยนถุงมือทันที นอกจากนี้ยังควรสวมเสื้อกาวน์ เพื่อให้มั่นใจว่าส่วนอื่นๆ ของร่างกายจะไม่สัมผัสกับตัวอย่างโดยตรง

5. ใช้สารเคมีและอุปกรณ์ที่ปลอดจาก RNase
       สามารถเลือกใช้ผลิตภัณฑ์ทำความสะอาด อุปกรณ์ใช้แล้วทิ้ง และสารเคมีอื่นๆ ที่ออกแบบมาเพื่อลดความเสี่ยงของการปนเปื้อน RNase และช่วยปกป้อง RNA ไม่ให้ถูกทำลาย น้ำยาทำความสะอาดพื้นผิวสามารถช่วยกำจัด RNase จากอุปกรณ์แก้ว โต๊ะปฏิบัติการ และปิเปตได้อย่างมีประสิทธิภาพ นอกจากนี้ควรตรวจสอบอุปกรณ์ที่ใช้แล้วทิ้งว่าได้รับการรับรองว่า ปลอดจาก RNase  (RNase free) และควรใช้ปลายปิเปตแบบมีฟิลเตอร์ (Filter tips) เพื่อป้องกันการปนเปื้อนจากปลายปิเปตหรือการปนเปื้อนข้ามตัวอย่าง

6. ทำการทดลองนำร่อง (Pilot Experiment)
       เนื่องจากขั้นตอนใดขั้นตอนหนึ่งในกระบวนการสกัด RNA อาจทำให้เกิดการปนเปื้อน RNase หรือชุดสกัดอาจไม่เหมาะกับชนิดของตัวอย่าง ดังนั้นเพื่อหลีกเลี่ยงความเสี่ยงในการสูญเสียตัวอย่าง จึงควรทำการทดลองนำร่อง (Pilot experiment) โดยใช้ตัวอย่างที่มีค่าน้อยกว่าก่อน เพื่อให้สามารถตรวจสอบและปรับแก้ปัญหาต่างๆ ในขั้นตอนการสกัด RNA ก่อนลงมือจริง

7. การคงสภาพ RNA
       RNA มีความไม่คงตัวและบางชนิดสลายตัวได้อย่างรวดเร็ว ดังนั้นหลังการเก็บตัวอย่างควรยับยั้งการทำงานของเอนไซม์ RNase โดยการทำลายเซลล์ (lysis) ทันทีด้วย TRIzol™ หรือ lysis buffer จากชุด PureLink™ RNA Mini Kit จากนั้นสามารถแช่แข็งตัวอย่างไว้ที่อุณหภูมิ -80°C เพื่อประมวลผลภายหลัง หรือเลือกสกัด RNA ทันทีหลังจากละลายตัวอย่างใน Lysis buffer ก็ได้ อีกทางเลือกหนึ่งคือการ Flash freeze ตัวอย่างด้วยไนโตรเจนเหลวทันทีหลังการเก็บ เพื่อป้องกันการเสื่อมสภาพของ RNA

8. การเพิ่มขั้นตอนการสลายเซลล์แบบเชิงกลหรือด้วยเอนไซม์
       ตัวอย่างบางชนิด เช่น เนื้อเยื่อที่ผ่านการตรึงและฝังพาราฟิน (FFPE), ตัวอย่างเลือด และจุลชีพบางชนิด มักสกัด RNA คุณภาพสูงได้ยาก จึงอาจจำเป็นต้องเพิ่มขั้นตอนการสลายเซลล์เพื่อให้เกิดการแตกตัวอย่างสมบูรณ์ ได้แก่

• การสลายเชิงกล (Mechanical lysis) เช่น การใช้ลูกปัดบดเซลล์ (bead-beating)
• การเตรียมตัวอย่างด้วยเอนไซม์ เช่น lysozyme หรือ proteinase K

     การสลายเซลล์ที่ไม่สมบูรณ์อาจลดประสิทธิภาพของการสกัด RNA โดยเฉพาะวิธีที่ใช้คอลัมน์ ดังนั้นก่อนเริ่มสกัด RNA จากตัวอย่างที่สกัดยาก ควรตรวจสอบคำแนะนำในคู่มือชุดสกัดว่ามีขั้นตอนเฉพาะสำหรับตัวอย่างชนิดนั้นหรือไม่

9. เก็บตัวอย่างให้เย็นอยู่เสมอ
       การเก็บรักษาตัวอย่างให้เย็นตลอดกระบวนการเป็นสิ่งสำคัญต่อความเสถียรของ RNA ซึ่งหากประสบปัญหาเกี่ยวกับเอนไซม์ RNase ควรใช้สารสกัดที่แช่เย็น ทำการสกัดในห้องเย็น หรือใช้เครื่องปั่นเหวี่ยงที่ตั้งอุณหภูมิเย็นล่วงหน้าในขั้นตอนการปั่นเหวี่ยง

10. กำจัดการปนเปื้อนของ DNA
       แม้ว่าชุดสกัด RNA และสารเคมีส่วนใหญ่จะสามารถกำจัด DNA จากจีโนมหรือพลาสมิดที่ปนเปื้อนได้อย่างมีประสิทธิภาพ แต่เทคนิคการวิเคราะห์บางวิธีในขั้นตอนถัดไป เช่น NanoDrop และ qRT-PCR มีความไวสูงและสามารถตรวจพบ DNA ปริมาณเล็กน้อย ซึ่งอาจรบกวนผลการวิเคราะห์ได้ เพื่อแก้ไขปัญหานี้ ชุดสกัดแบบใช้คอลัมน์หลายชนิดจึงมีการรวมขั้นตอนการย่อย DNA ด้วย DNase I เช่น PureLink™ DNase ซึ่งสามารถใช้กำจัด DNA บนคอลัมน์โดยตรง หรือเลือกย่อย DNA หลังการสกัด RNA ก็ได้เช่นกัน

11. วัดปริมาณ RNA และตรวจสอบคุณภาพ
       หลังการทำให้บริสุทธิ์ ควรตรวจสอบทั้งปริมาณและคุณภาพของ RNA อย่างเหมาะสม วิธีพื้นฐานคือการวัดการดูดกลืนแสง UV ที่ความยาวคลื่น 260 นาโนเมตร (กรดนิวคลีอิก), 280 นาโนเมตร (โปรตีนที่ปนเปื้อน) และ 230 นาโนเมตร (สารปนเปื้อนอื่น เช่น ฟีนอลหรือกวานิดีน) โดยสามารถประเมินความบริสุทธิ์ของ RNA จากอัตราส่วน A260/A280 ซึ่งควรอยู่ในช่วง 1.8–2.2 และ A260/A230 ซึ่งควรมากกว่า 1.7
       นอกจากนี้ สามารถใช้เครื่อง Fluorometer เช่น Qubit Fluorometer เพื่อวัดปริมาณ RNA ได้อย่างแม่นยำและมีความไวสูงกว่า โดยเฉพาะในตัวอย่างที่มีความเข้มข้นต่ำ อีกทางเลือกหนึ่งคือเทคนิค ไมโครฟลูอิดิกส์ ซึ่งช่วยประเมินทั้งปริมาณและความสมบูรณ์ของ RNA ผ่านการแยกขนาดด้วย electrophoresis และการตรวจวัดสัญญาณเรืองแสง ทำให้สามารถตรวจพบการปนเปื้อนของ DNA หรือการสลายตัวของ RNA และรายงานผลเป็นค่าดัชนีความสมบูรณ์ของ RNA (RNA Integrity Number; RIN)

รูปที่ 2 Qubit Fluorometer ใช้ควบคู่กับ Qubit assay kit และ Qubit assay tube

12. การจัดเก็บ RNA ที่บริสุทธิ์
       ชุดสกัด RNA แบบใช้คอลัมน์หรือ bead มักมาพร้อม RNase-free elution buffer ซึ่งช่วยคงความสมบูรณ์ของ RNA ได้ดี สำหรับการสกัดด้วย TRIzol™ สามารถละลาย RNA pellet ที่แห้งแล้วใน RNase-free water หรือน้ำยาจัดเก็บเฉพาะทาง หลังจากวัดปริมาณ RNA แล้ว ควรแบ่งตัวอย่างออกเป็น aliquot สำหรับใช้ครั้งเดียว เพื่อลดการแช่แข็ง–ละลายซ้ำ ซึ่งอาจทำให้ RNA เสื่อมสภาพหรือปนเปื้อน RNase ได้ การเก็บรักษาในระยะสั้นควรเก็บที่ -20°C ส่วนการเก็บในระยะยาวควรเก็บที่ -80°C

13. การสกัด RNA แบบอัตโนมัติ
       ปัจจุบันมีชุดสกัด RNA หลายชนิดที่สามารถใช้งานร่วมกับ ระบบสกัดและทำให้บริสุทธิ์แบบอัตโนมัติ การใช้ระบบอัตโนมัติช่วยลดความเสี่ยงจากการปนเปื้อน RNase ที่เกิดจากการสัมผัส เพิ่มความสม่ำเสมอของผลลัพธ์ และลดเวลาในการเตรียมตัวอย่างเมื่อเทียบกับการทำงานด้วยมือ

รายละเอียดเพิ่มเติม : https://www.thermofisher.com/blog/life-in-the-lab/14-tips-for-a-successful-rna-extraction/
หรือติดต่อแผนก Technical Support e-mail: TAS@3nholding.com หรือฝ่ายงาน Life Science Product โทร 02-274-8331

บทความโดย สุภิสรา ธนบัตร

Technical Application Specialist