หลักการพื้นฐานเกี่ยวกับการทำ In Vitro Transcription

In Vitro Transcription คืออะไร

   In Vitro Transcription (IVT) คือกระบวนการสังเคราะห์ RNA จาก DNA template ที่ทำในหลอดทดลอง (นอกเซลล์) ใช้กันอย่างแพร่หลายในงานชีววิทยาระดับโมเลกุล งานวิจัย และการพัฒนา mRNA เพื่อการรักษาThermo Fisher Scientific มีผลิตภัณฑ์ที่รองรับกระบวนการ IVT อย่างครบวงจร ตั้งแต่ขั้นตอนการสังเคราะห์ไปจนถึงการนำไปใช้งานในงานวิจัยและการแพทย์

หลักการพื้นฐานของ IVT

กระบวนการทาง IVT มีองค์ประกอบที่ใช้เป็นส่วนประกอบหลัก ได้แก่

• DNA template ที่มี promoter ของเอนไซม์ phage (T7, T3 หรือ SP6)
• RNA polymerase เพื่อเริ่มกระบวนการถอดรหัส
• NTPs (ATP, CTP, GTP, UTP) เป็นวัตถุดิบให้การสังเคราะห์สายของ RNA
• Buffer system ที่มี DTT และแมกนีเซียม ช่วยรักษาสภาวะที่เหมาะสมให้เอนไซม์ทำงานได้ดี

**กระบวนการ IVT สามารถเพิ่มจำนวนได้ตั้งแต่ระดับไมโครกรัม ไปจนถึง มิลลิกรัม ซึ่งสามารถปรับได้ตามความเหมาะสมของแต่ละงาน

กระบวนการหลักในการสังเคราะห์ IVT mRNA

1. การเตรียม DNA Template: เตรียม DNA ที่ใช้เป็นต้นแบบ โดยต้องมี

• Promoter สำหรับเอนไซม์ถอดรหัส (เช่น T7, T3, SP6)
• ยีนหรือรหัสโปรตีนที่ต้องการ (Coding sequence)
• ส่วน UTRs เพื่อช่วยเพิ่มความเสถียรและประสิทธิภาพการแปลรหัส

2. ปฏิกิริยา In Vitro Transcription (IVT): นำ DNA template มาทำปฏิกิริยากับ

• RNA polymerase (เช่น T7)
• สารตั้งต้น NTPs (ATP, CTP, GTP, UTP)
• Buffer ที่เหมาะสม
  เพื่อสังเคราะห์ mRNA ในหลอดทดลอง

3. การเติมหมวก 5′ (5′ Capping): ช่วยให้ mRNA มีความเสถียรและสามารถถูกแปลเป็นโปรตีนได้

• ทำได้ระหว่างการสังเคราะห์ RNA (co-transcriptional)
• หรือเติมภายหลังด้วยเอนไซม์ (post-transcriptional)

4. การเติมหาง Poly(A) ที่ปลาย 3′: ช่วยเพิ่มอายุการใช้งานและประสิทธิภาพในการสร้างโปรตีน

• ใส่ไว้ใน DNA template ตั้งแต่ต้น
• หรือเติมภายหลังด้วยเอนไซม์ Poly(A) polymerase

5. การทำให้บริสุทธิ์ (Purification): กำจัดสิ่งเจือปน เช่น DNA ที่เหลือ NTPs และ dsRNA

• ใช้วิธี spin column, magnetic beads
• หรือโครมาโทกราฟี
• รวมถึงการย่อย DNA template ด้วย DNase

    สรุปคือ กระบวนการ IVT mRNA เริ่มจากการเตรียม DNA → สังเคราะห์ RNA → ปรับโครงสร้างให้เสถียร → ทำให้บริสุทธิ์ พร้อมสำหรับการนำไปใช้งานต่อ

การประยุกต์ใช้งาน IVT ในงานวิจัย

          สเกลขนาดเล็ก (Small-scale)
เหมาะสำหรับการผลิต RNA ปริมาณน้อย เพื่อนำไปใช้เป็น RNA probes, งาน RNA blot และการศึกษากลไกระดับโมเลกุลพื้นฐาน

         สเกลขนาดใหญ่ (Large-scale)
เหมาะสำหรับการผลิต RNA ปริมาณมาก ใช้ในงาน microarray, RNA-Seq, qPCR รวมถึงงาน functional studies เพื่อศึกษาการแปลเป็นโปรตีน เช่น microinjection และ in vitro translation ตลอดจนงานโครงสร้างโมเลกุล เช่น X-ray crystallography และ NMR

ผลิตภัณฑ์ IVT จาก Thermo Fisher Scientific

    บริษัท กิบไทย จำกัด เป็นตัวแทนจำหน่ายชุด IVT ของแบรนด์ Thermo Fisher ซึ่งมีชุด IVT Kits ที่เป็นที่นิยม และมีความยืดหยุ่นสูง ซึ่งได้แก่:

1. MEGAscript T7 Transcription Kit Plus – สำหรับสังเคราะห์ mRNA แบบไม่ต้อง capping
2. mMessage mMachine T7 Kit – รวม m7G cap ให้การสังเคราะห์ mRNA พร้อมใช้งาน
3. mMessage mMachine T7 with CleanCap Reagent AG – ใช้เทคโนโลยี capping รุ่นใหม่ (CleanCap® Reagent AG)
4. mMessage mMachine T7 Ultra Kit – ชุดครบครัน พร้อม ARCA cap และ poly(A) tail ในชุดเดียว

จุดเด่นของผลิตภัณฑ์:

• ความยืดหยุ่นสูง สามารถปรับใช้ modified nucleotides, self-caps ได้
• ผลผลิตสูง (yield) และใช้งานง่าย ด้วยโปรโตคอลที่ปรับให้พร้อมใช้งาน
• รองรับ GMP scale-up ด้วยชุด TheraPure ที่ปรับใช้กับงานพัฒนา mRNA ระดับอุตสาหกรรม

ศึกษาข้อมูลเพิ่มเติม:
หรือติดต่อแผนก Technical Support e-mail: TAS@3nholding.com
หรือฝ่ายงาน Life Science Product โทร 02-274-8331
ศึกษาข้อมูลเพิ่มเติม https://www.thermofisher.com/us/en/home/industrial/pharma-biopharma/nucleic-acid-therapeutic-development-solutions/mrna-research/overview-in-vitro-transcription.html#templates
ผู้เขียน: ชนิษฐา ไตรรัตน์อภิบาล (Technical Application Specialist for molecular biology products)