Technical Note : ข้อมูลทางเทคนิค
การแสดงออกของโปรตีน (protein expression ) ในแบคทีเรีย
Life Science
การทำ protein expression เป็นอีกเทคนิคหนึ่งที่เป็นทางเลือกให้กับนักพันธุวิศวกรรม ที่ต้องการจะผลิตโปรตีนที่ต้องการศึกษาในเวคเตอร์ที่ต้องการ
การแสดงออกของโปรตีน (protein expression ) ในแบคทีเรีย
การทำ protein expression เป็นอีกเทคนิคหนึ่งที่เป็นทางเลือกให้กับนักพันธุวิศวกรรม ที่ต้องการจะผลิตโปรตีนที่ต้องการศึกษาในเวคเตอร์ที่ต้องการ โดยอาศัยเทคนิคทางพันธุวิศวกรรม โดยปกติแล้วในสิ่งมีชีวิตทั่วๆไปมีการผลิตโปรตีนในเซลล์อยู่แล้ว ซึ่งโปรตีนบางตัวถูกผลิตมากบ้าง น้อยบ้าง ดังนั้นหากจะทำการสกัดโปรตีนเหล่านั้นออกมาเพื่อศึกษา อาจจะเป็นการยากหรือต้องใช้เวลานาน ดังนั้นจึงมีเทคนิคที่เรียกว่าการตัดต่อยีนเข้าเวคเตอร์และทำการย้ายเข้าสู่เซลล์เจ้าบ้านที่มีให้เลือกทั้งโปรคารีโอต เช่น E.coli หรือยูคารีโอต เช่น yeast, insect cell, mammalian cell เรียกโปรตีนที่ได้ว่าโปรตีนเชื่อมต่อหรือโปรตีนลูกผสม (recombinant protein)
การแสดงออกของยีน (gene expression) เป็นกระบวนการที่เกี่ยวข้องกับ protein expression เพราะยีนเป็นแม่พิมพ์หรือต้นแบบให้มีการสร้างอาร์เอ็นเอและโปรตีนออกมา(ดังรูปที่ 1) ดังนั้นการแสดงออกของยีนจึงมีผลผลิตเป็นโปรตีน ดังนั้นการควบคุมการแสดงออกของยีนประกอบด้วยขั้นตอนสองขั้นตอนคือ ขั้นตอนการถอดรหัสจากดีเอ็นเอเป็นอาร์เอ็นเอส่งข่าว (mRNA) และขั้นตอนการแปลรหัสจากลำดับเบสของ mRNA เป็นลำดับกรดอะมิโนของโปรตีน ส่วนใหญ่ในแบคทีเรียจะเกิดการควบคุมการแสดงออกของยีนในขั้นตอนการแปลรหัส ส่วนในยูคารีโอตมีการควบคุมที่ซับซ้อนกว่าเนื่องจากโปรตีนมีความซับซ้อน
ในแบคทีเรียการแสดงออกของโปรตีนจะมีการแสดงออกที่มีผลควบคุมมาจากยีนที่เป็นลักษณะเป็นกลุ่มเรียกว่า โอเพอรอน (operon) ซึ่งประกอบด้วยยีนโครงสร้าง (structural gene) ยีนควบคุม (regulatory gene) และบริเวณบังคับการ (control site) ซึ่งแบ่งเป็นสองส่วนย่อยคือ ยีนส่งเสริม (promoter gene, p) และยีนดำเนินการ (operator gene, o) ยีนควบคุมและยีนโครงสร้างจะมีข้อมูลพันธุกรรมที่จะถูกถอดรหัสเป็น mRNA แล้วแปลเป็นลำดับกรดอะมิโนของโปรตีนต่อไป ในกระบวนการแสดงออก (expression) ของยีนโครงสร้างหรือการสร้างโปรตีนจากยีนโครงสร้าง เอนไซม์ RNA polymerase จะเข้าจับที่ promoter แล้วเคลื่อนไปยังยีนโครงสร้างเพื่อสังเคราะห์ mRNA แต่ถ้ามีตัวกดดันมาจับที่ operator gene จะทำให้ RNA polymerase เข้าจับที่ promoter ไม่ได้ การสร้างโปรตีนก็จะถูกยับยั้ง (ดังรูปที่ 2) ซึ่งเป็นที่มาของทฤษฎีโอเพอรอน ดังนั้นนักวิทยาศาสตร์จึงใช้หลักการนี้ในการสร้างรีคอมบิแนนท์โปรตีนที่ต้องการในเซลล์แบคทีเรียได้ โดยใช้ตัว inducer ชักนำให้มีการผลิตโปรตีนให้มากๆ
ข้อดีและข้อเสียของการใช้เซลล์เจ้าบ้านต่างๆ
| เซลล์เจ้าบ้าน | ข้อดี | ข้อเสีย |
| 1. E. coli | - ใช้ได้กับดีเอ็นเอทั่วไป - ควบคุมการแสดงออกของยีนได้ง่าย - ผลผลิตของโปรตีนสายผสมสูงถึง50%ของโปรตีนทั้งหมดในเซลล์ - เจริญเติบโตง่าย -โปรตีนลูกผสมอยู่ในรูปของโปรตีนเชื่อมต่อ - ออกแบบให้มีการสร้างโปรตีนสายผสมออกมาในอาหารเลี้ยงเซลล์ (extracellular) |
-โปรตีนสายผสมไม่มี post-translational modification - คุณสมบัติทางชีวภาพของโปรตีนต่างจากโปรตีนในธรรมชาติ - แบคทีเรียแกรมลบมี endotoxin สูง - ถ้ามีการแสดงออกมากเกินไป (over expression) จะเกิดการรวมตัวของโปรตีนในรูป inclusion bodies ทำให้แยกโปรตีนให้บริสุทธิ์ยาก |
| 2. Yeast (S.cerevisiae) |
- ไม่มี endotoxins - ไม่ทำให้เกิดโรคในคน - มีกระบวนการ glycosylation - นำไปใช้ในระบบ large scale ได้ |
- ควบคุมการแสดงออกของยีนได้ยาก - การใช้ดีเอ็นเอพาหะสำหรับยีสต์ยังยุ่งยากและไม่สะดวก - กระบวนการ glycosylation ไม่เหมือนในสัตว์ |
| 3. เซลล์แมลง (cultured in sect cells) |
- baculovirus vector - มีกลไกในการสร้างโปรตีนได้หลายชนิดเหมาะสำหรับโปรตีนของยูคารีโอตชั้นสูง |
- ขาดข้อมูลของกระบวนการ glycosylation -โปรตีนสายผสมมีแอคติวิตีไม่ถึง 100% |
| 4.mammalian cell | -แอคติวิตีทางชีวภาพของโปรตีนเหมือนกับโปรตีนในธรรมชาติ -การเพาะเลี้ยงสามารถทำได้ในปริมาณมากๆ |
- มีความยุ่งยากในการเพาะเลี้ยงเซลล์และราคาแพง - การเจริญเติบโตของเซลล์ช้า - พันธุกรรมของเซลล์ไม่เสถียรภาพ -ปริมาณโปรตีนสายผสมที่ได้มีปริมาณต่ำเมื่อเทียบกับจุลินทรีย์ |
Related product
1. bacterial expression system
