Spectrophotometer

           Spectrophotometer เป็นเครื่องมือที่ใช้วัดปริมาณของ สารเคมี ชีวโมเลกุล รวมถึงจุลชีพทั้งหลาย โดยใช้หลักการวัดปริมาณของแสงที่ตัวอย่างดูดกลืนเข้าไป ตัวเครื่องประกอบด้วยแหล่งกำเนิดแสง (Light source) เลนส์ หรือกระจกรับแสง (Lens or Mirror) ตัวแยกความยาวคลื่น (Monochromator) และ ตัวตรวจจับสัญญาณ (Detector) ดังแสดงในรูปที่ 1
           แหล่งกำเนิดแสงทำหน้าที่ให้แสงผ่านตัวอย่าง แหล่งกำเนิดแสงที่ดีควรให้แสงที่มีความเข้มสม่ำเสมอ และนิ่งตลอดความยาวคลื่นที่ใช้งาน ปัจจุบันแหล่งกำเนิดแสงที่นิยมนำมาใช้มีหลากหลายชนิดยกตัวอย่างเช่น Deuterium Arc (190-420 nm), Tungsten (350-2500 nm), และ Xenon Lamp (190-800 nm) อีกส่วนประกอบหนึ่งที่สำคัญนั้นคือตัวตรวจจับสัญญาณ สำหรับเครื่องตรวจวัดที่นิยมใช้ ได้แก่ PMT (photomultiplier tube), diode arrays และ CCDs (charge coupled devices) เครื่อง จะทำการบันทึกค่าความยาวคลื่นร่วมกับค่ามุมของแต่ละความยาวคลื่นที่เกิดการดูดกลืน ในการวัดตัวอย่างจะใช้ cuvette ซึ่งลักษณะเป็นหลอดสี่เหลี่ยมเล็กทำจากแก้ว  พลาสติก หรือควอตซ์ ซึ่งแต่ละชนิดมีข้อดีแตกต่างกันคือ cuvette ที่ทำจากควอตซ์จะมีราคาแพงแต่สามารถวัดได้ที่ความยาวคลื่นได้ทั้ง UV-vis ขณะที่ cuvette ที่ทำจากพลาสติก หรือแก้วจะวัดได้แค่แสงสีขาว (vis) เท่านั้น

รูปที่ 1. แสดงหลักการทำงานของเครื่อง spectrophotometer

           นอกจาก Spectrometry ยังมีอีกวิธีที่เป็นที่นิยมเนื่องจากสามารถวัดตัวอย่างที่มีปริมาณน้อยมากได้ (high sensitivity) นั้นคือ Fluorometry ซึ่งมีหลักการในการวัดปริมาณแสง fluorescence ของตัวอย่าง (Fluorophore) หรือ Fluorophore ที่ติดอยู่กับตัวอย่าง ดังนั้นปริมาณของตัวอย่างที่มีความเข้มข้นมากก็จะทำให้ปริมาณแสง fluorescence ที่วัดได้มีความเข้มมากด้วย ซึ่งสามารถวัดออกมาเป็นหน่วยที่เรียกว่า Quantum Yield (Φ) นั้นคืออัตราส่วนของปริมาณ photon ที่ตัวอย่างดูดกลืน ต่อปริมาณของ photon ที่ตัวอย่างคายออกมา เครื่องมือที่ใช้วัดปริมาณแสง fluorescence นั้นคือ Fluorometer ซึ่งมีหลักการคล้ายกับตัว Spectrometer นั้นมีต้องมีแหล่งกำเนิดแสงเพื่อให้พลังงานกระตุ้น Fluorophore ให้คายพลังงานออกมาเป็นแสง fluorescence จากนั้นต้องมีตัว Filter ซึ่งทำหน้าที่ในการรับแสงที่ความยาวคลื่นที่ตัวอย่างคายออกมา และ Detector ตัวรับสัญญาณเพื่อวิเคราะห์ข้อมูลตามลำดับ ตัวอย่างของเครื่อง Fluorometer ที่มีประสิทธิภาพสูงนั้นก็คือ Qubit Fluorometer (รูปที่ 2.) ซึ่งสามารถวัดได้ทั้งตัวอย่างที่เป็น DNA, RNA, และ Protein

รูปที่ 2. Qubit Fluorometer

           ปัจจุบันการพัฒนาเครื่อง Spectrophotometer ให้ใช้ตัวอย่างที่มีปริมาณน้อยพร้อมกับความมีประสิทธิภาพในการทำงานสูงนั้นทำให้นำไปสู่ระบบที่เรียกว่า Cuvette-less spectrophotometer ซึ่งใช้ปริมาณของตัวอย่างที่วัดในระดับ microlite และให้ความถูกต้องแม้นยำสูง
หนึ่งในบริษัทที่มีการพัฒนาเครื่องชนิดนี้คือ MALCOM จากประเทศญี่ปุ่น ซึ่งเป็นประเทศที่มีมาตรฐาน และเทคโนโลยีในการผลิตสูง ได้ผลิตเครื่อง ES-2 หรือ e-spect (รูปที่ 3.) ซึ่งเป็นเครื่องที่มีความสามารถหลากหลาย นอกจากสามารถวัดความยาวคลื่นในช่วงที่เป็น UV-vis ได้ ยังสามารถวัดตัวอย่างที่เป็น Fluorescence (AlexaFluor 488, Cy5, Qdot 565), Protein Assays (Lowry BCA, Bladford, etc.), และ nucleic acid (dsDNA, ssDNA, RNA, oligonucleotide)ได้เช่นกัน

รูปที่ 3. เครื่อง micro UV-vis fluorescence spectrophotometer: e-spect

            ตัวเครื่องถูกออกแบบให้มีน้ำหนักเบา และขนาดเล็กประหยัดพื้นที่ในการติดตั้ง ตัวเซลล์ที่ใช้ใส่ตัวอย่างเพื่อวัดทำจากควอตซ์ โดยปริมาณตัวอย่างที่ใช้แค่ 1 µL เท่านั้น เครื่องจะประมวลผลและแสดงให้เห็นบนหน้าจอ LCD นอกจากนี้หน่วยความจำในเครื่องสามารถจดจำค่าที่วัดได้ถึง 200 ตัวอย่าง ค่าที่ได้จากการวัดนั้นสามารถถ่ายข้อมูลจากเครื่องผ่านลง thump drive หรือทำการพรินผลการทดลองจากการเชื่อมต่อกับพรินเตอร์ได้ มีช่องสำหรับเชื่อมต่อกับเครื่องคอมพิวเตอร์เพื่อควบคุมการทำงานผ่านหน้าจอคอมพิวเตอร์ คุณสมบัติของเครื่องต่าง ๆ ได้แสดงดังตารางข้างล่าง ซึ่งแสดงให้เห็นถึงเครื่องนั้นมีประสิทธิภาพสูง ดังนั้น e-spect จึงเป็นอีกทางเลือกสำหรับเครื่อง micro spectrophotometer ที่คุ้มค่ากับเงินที่ต้องจ่ายไป

ข้อมูลเพิ่มเติม:
www.invitrogen.com
http://www.malcom.co.jp/eng/product/es-2.html