RNAi Technology เป็นเทคโนโลยี ที่ถูกค้นพบใน C.elegans ปี 1998 โดย Fire and Mello จากการค้นพบ RNAi ในครั้งนั้น ในปัจจุบัน RNAi เป็นเทคนิคที่ใช้ในการศึกษาหน้าที่ของยีน (Functional) และจำแนกยีน (Identification) ใน Human genome ค่อนข้างมาก ซึ่งยีนเหล่านี้เกี่ยวข้องกับการเกิดโรคในคน โดยหลักการของเทคนิค RNAi คือเทคนิคที่ยั้บยั้งการแสดงออกของยีนที่ต้องการศึกษาในระดับอาร์เอ็นจนถึงโปรตีน ซึ่งต่อมาอาจมีผลทำให้การตอบสนองขององค์ประกอบภายในเ้ซลล์ ต่อ signal pathway นั้น ๆ เปลี่ยนไป เมื่อเปรียบเทียบกับการยับยั้งการแสดงออกของยีน เทคนิคอื่นๆ เช่น antisense หรือ ribosome ดังนั้นเทคนิค RNAi จึงมีความจำเพาะและมีประสิทธิภาพอย่างมากในการศึกษาหน้าที่ของจีนในสิ่งมีชีวิต มากกว่าเทคนิคอื่นๆในปัจจุบัน

เทคนิค RNAi มีหลักการเริ่มต้นจาก double-stranded short interfering RNA (siRNA) ที่อยู่ในนิวเคลียส ถูกส่งอออกนอกนิวเคลียสไปยังไซโตพลาสม แล้วหนึ่งสายของ siRNA จะเข้าไปจับกับ RNA-Induce Silencing
Complex (RISC) จากนั้น complex นี้จะมุ่งตรงไปยังอาร์เอ็นเป้าหมาย เพื่อย่อยอาร์เอ็นเป้าหมายให้เป็นสายอาร์เอ็นเอสายสั้นๆ ด้วยเอนไซม์ Nuclease ที่อยู่ใน RISC complex จากนั้นอาร์เอ็นเอสายสั้น ๆ นี้ จะถูกทำลายด้วยเอนไซม์ cytoplasmic exonuclease ซึ่งมีผลทำให้ไม่มีการแสดงออกของยีนเป้าหมายในระดับอาร์เอ็นและโปรตีน อาจเรียกรวมว่าเทคนิค knock down ยีนในระดับ post transcription ดังรูป

ในการศึกษา RNAi เทคนิคนั้นต้องทำการออกแบบการทดลองให้เหมาะสมในทุกๆขั้นตอน เพื่อให้การทดลองประสบความสำเร็จ ซึ่งปัจจุบัน Invitrogen มีระบบหรือน้ำยาที่เกี่ยวข้องกับการศึกษางานทางด้าน RNAi ตั้งแต่ขั้นการออกแบบ RNAi จนถึงขั้นตอน

การศึกษาผลของการยั้บยั้งการแสดงออกของยีนที่ต้องการศึกษา ดังนี้
1. ออกแบบยีนเป้าหมายสำหรับศึกษา RNAi (Design target for RNAi Analysis)
2. สร้าง RNA Oligo สำหรับศึกษา RNAi (Generate RNA oligos for RNAi Analysis)
3. การนำ RNA oligo ที่สร้างขึ้นเข้าสู่ cell line ที่ต้องการศึกษา (Delivery into cell)
4. ตรวจสอบผลการทดลองการยับยั้งยีนเป้าหมาย ( Verification of Gene Silencing)

การออกแบบยีนเป้าหมายสำหรับการศึกษา RNAi (Design target for RNAi Analysis)
เพื่อให้การออกแบบยีนเป้าหมายที่ต้องการศึกษาให้ได้อย่างถูกต้อง ในเว็บไซต์ของ Invitrogen นั้นมี online design tool ชื่อว่าโปรแกรม Block-iT RNAi Designer เพื่อออกแบบหา RNAi เป้าหมาย โดยสามารถออกแบบจากการใส่ GenBank accession number หรือ nucleotide sequences ของยีนที่ต้องการศึกษาลงไป จากนั้น RNAi designer จะสังเคราะห์ออกมาเป็นรูปแบบของ Stealth RNAi หรือ siRNA หรือ shRNAi หรือ miR RNAi โดยผลที่ได้จากการออกแบบด้วย RNAi designer นั้นจะมี RNA oligo ที่สามารถยับยั้งยีนเป้าหมายได้มากที่สุด 10 อันดับให้เลือก

การสร้าง RNA oligo สำหรับการศึกษา RNAi (Generate RNA Oligos for RNAi Analysis)
หลังจากทำการออกแบบหาว่าตำแหน่งใดที่สามารถสร้างให้เป็นตำแหน่งที่สามารถยับยั้งยีนเป้าหมายได้แล้วนั้น จึงทำการสังเคราห์ RNA oligo นั้นออกมา โดยสามารถสังเคราะห์ RNA oligo ออกมาได้หลายรูปแบบดังนี้
1. แบบ Stealth RNA หรือ siRNA
เป็น chemical-modified double stranded RNA ขนาด 25 นิวคลีโอไทด์ และเป็น blunt-ended duplex ที่ได้พัฒนาจาก siRNA เพื่อให้เพิ่มประสิทธิภาพ และเพิ่มความจำเพาะ ในการยับยั้งอาร์เอ็นเอเป้าหมาย นอกจากนั้น stealth RNAi จะไม่กระตุ้น cellular stress response และมีความคงทนเมื่ออยู่ใน serum มากกว่า siRNA ด้วย โดย stealth RNAi สามารถแบ่งออกได้ดังนี้

Validated Stealth RNAi DuoPak เป็น stealth RNAi ที่ผ่านการทดสอบมาแล้วว่าสามารถยับยั้งการแสดงออกของยีนที่สนใจได้มากกว่า 70 % จริง โดยสามารถสั่งซื้อ Validated Stealth RNAi DuoPaks ได้ที่โปรแกรม Block-iT RNAi Expression ที่อยู่ในเว็บไซต์ของ Invitrogen ภายในชุด Validated stealth RNAi DuoPak นี้จะประกอบด้วย non-overlapping sequence 2 duplex RNA ต่ออาร์เอ็นหรือยีนเป้าหมายที่ต้องการยับยั้ง ดังรูป

Stealth select RNAi 3 RNAi set เป็น pre-selected และ ready to order duplex ต่อยีนของ Human mouse และ Rat ภายในชุด stealth select 3 นี้ จะประกอบด้วย non-overlapping sequence 3 duplex RNA ต่ออาร์เอ็นหรือยีนเป้าหมายที่ต้องการยับยั้ง เมื่อต้องการทำการการทดลองโดยใช้ Validated Stealth RNAi แล้วยีนนั้นๆ ยังไม่่มีการทดสอบให้เป็น Validated ก็สามารถเลือก stealth select RNAi 3 ไปทำการทดลองได้ จากโปรแกรม Block-iT RNAi Express ที่อยู่ในเว็บไซต์ของ Invitrogen ได้เช่นเดียวกัน

Custom Stealth RNAi molecules เป็น stealth RNAi ที่สามารถออกแบบและสั่งซื้อได้เองผ่านทางโปรแกรม Block-iT RNAi Designer ที่อยู่ในเว็บไซต์ของ Invitrogen

Custom Block-iT siRNA เป็น siRNA ที่สามารถเข้าไปออกแบบและสั่งซื้อผ่านโปรแกรม Block-iT RNAi designer โดยสามารถสั่งสังเคราะห์ได้ทั้งแบบ single-stranded oligo หรือ duplex siRNA โดยขนาด standard size อยู่ที่ 21-23 นิวคลีโอไทด์ หรือ custome size ที่มีขนาดประมาณ 10-50 นิวคลีโอไทด์ ซึ่งทั้ง 2 แบบต้องมีเบสไทมิดีน 2 ตัวติดอยู่ที่ปลายด้าย 3 ด้วย (3’ TT-overhang)

RNAi designer services โดย Invitrogen รับบริการการออกแบบการทดลอง พร้อมทั้งทำการทดสอบ RNAi molecule นั้นๆ ให้ด้วย

2. การสังเคราะห์ RNA oligo โดยอาศัยหลักการ In vitro transcription
เป็นหลักการการถอดรหัสจากสาย RNA นั้น ๆ แล้วสังเคราะห์ให้ได้ dsRNA จากนั้นทำการตัดสาย dsRNA ที่มีขนาดยาวให้เป็นสายเล็ก ๆ ขนาดประมาณ 21-23 นิวคลีโอไทด์ ด้วยเอนไซม์ dicer ซึ่ง dsRNA สายสั้นๆ นี้ เรียกว่า diced dsRNA เทคนิคนี้เป็นเทคนิคที่ค่อนข้างประหยัด แต่ก็มีข้อจำกัดคือ diced dsRNA สามารถจับกับ RNA ที่สนใจได้อย่างไม่จำเพาะ เพราะมีขนาดเล็ก และ diced dsRNA สามารถยับยั้งการแสดงออกของยีนที่สนใจได้ในระยะสั้นเท่านั้น ซึ่งชุดน้ำยาที่สามารถสังเคราะห์สาย dsRNA สายยาวได้ คือชุด Block-iT RNAi TOPO transcription kit และ Block-iT Dicer RNAi transfection kit ใช้เพื่อตัดสาย dsRNA สายยาวให้เป็น siRNA ขนาด 21-23
นิวคลีโอไทด์

3. การสังเคราะห์ RNA oligo โดยใช้เวคเตอร์เข้ามาช่วย(vector-based RNAi)
เป็นเทคนิคที่สามารถสร้าง Micro RNAs (miRNAs) หรือ short hair pin RNAs (shRNAs) จากเวคเตอร์ ประกอบด้วย 2 ระบบคือ

Block-iT Pol II miRNAi Expression vector เป็นชุดน้ำยาที่ใช้สังเคราะห์ miR RNA จากเวคเตอร์ และ ชุดน้ำยา Validated miRNA vector DuoPak ที่มี miRNA ที่ผ่านการทดสอบมาแล้วว่าสามารถยับยั้งการแสดงออกของยีนที่สนใจได้มากกว่า 70 % จริง โดยปัจจุบัน มี Validated miRNA vector DuoPak ประมาณ 50 ยีนที่สามารถเลือกสั่งซื้อได้ที่โปรแกรม Block-iT RNAi Expression ที่อยู่ใน Website
ของ Invitrogen ภายในชุด Validated miRNA vector DuoPak นี้จะประกอบด้วย non-overlapping sequence 2 duplex RNA ต่ออาร์เอ็นหรือยีนเป้าหมายที่ต้องการยับยั้ง ดังรูป

Block-iT shRNA Expression vector ชุดน้ำยานี้จะสังเคราะห์ short hair pin RNA ให้ผ่านทางเวคเตอร์ที่ถูกควบคุมด้วย inducible regulation promoter (Block-iT Inducible H1 RNAi entry vector kit ) หรือ constitutive promoter (Block-iT U6 entry vector kit)

การตรวจสอบผลการทดลองการยับยั้งยีนเป้าหมาย (Verification of Gene Silencing)
หลังจากที่ทำการนำ RNA oligo เข้าสู่ cell line นั้น สามารถศึกษาผลและวัดผลการทดลองที่เกิดขึ้นจากการยับยั้งการแสดงออกของยีนเป้าหมายได้วิธีดังนี้ คือ
1. mRNA quantitation เป็นการศึกษาผลของการยับยั้งการแสดงออกของยีน โดยดูจากระดับของ mRNA ที่ถูกยับยั้งในเซลล์ ด้วยเทคนิค quantitative RT-PCR
2. วัดระดับโปรตีนด้วยการทำ western blot และ ตรวจตามด้วยแอนตี้บอดี้ต่อโปรตีนนั้นๆ
3. Functional analysis เป็นการศึกษาผลของ RNA oligo ต่อ cell function และ structure

- Apoptosis Detection เป็นเทคนิคที่ใช้ศึกษา characteristic biochemical และ morphology ที่เกิดขึ้นระหว่างการเกิด apoptosis เช่น ตรวจสอบ chromatin condensation หรือตรวจสอบ plasma membrane integrity หรือตรวจสอบ cytochrome c release จาก mitrochondria หรือตรวจสอบ phosphatidylserine exposure

- Viability and Vitality เป็นเทคนิคที่ใช้ทดสอบว่าเมื่อนำ RNA oligo เข้าสู่เซลล์ ควรใช้ RNA oligo มากน้อยแค่ไหนที่เหมาะสมกับเซลล์และไม่ทำให้เซลล์ตาย

- Cellular phenotypic changes เป็นเทคนิคที่ใช้ดูการเปลี่ยนแปลงรูปร่างของเซลล์นั้นหลังจากถูกยั้บยั้งการแสดงออก และการสร้างโปรตีนลดลง

RNAi central เป็นเว็บไซต์ที่รวบรวมงานการประยุกต์ใช้เทคนิค RNAi ขั้นตอนในการทำการทดลอง รวมทั้ง reference ของงานที่เกี่ยวกับ RNAi ทั้งหมดไว้ใน Invitrogen website โดยสามารถเข้าไปผ่านทาง www.invitrogen.com/rnai เมื่อเข้าไปในหน้าจอดังกล่าวแล้วสามารเข้าไปค้นหาข้อมูลต่างๆ ได้เช่น

- Block-iT RNAi Product : รวบรวมชุดน้ำยาทั้งหมดของ Invitrogen เช่น stealth RNAi, siRNA, Pol II miR RNAi vectors, shRNA vectors และ other RNAi product

- Online Tools: รวบรวมโปรแกรมที่ใช้ในการออกแบบและสังเคราะห์ RNA oligo เช่น Block-iT RNAi express and Block-iT RNAi designer

- Resources: รวบรวมข้อมูลพื้นฐานเมื่อต้องการอยากทราบว่า RNAi คืออะไรและ มีหลักการพื้นฐานอย่างไร

- Current Research and News: รวบรวม references และ publication ใหม่ๆ ของงานทางด้าน RNAi