Western blot หรือ Immunoblot เป็นเทคนิคที่นิยมใช้ในงานอณูวิทยาและภูมิคุ้มกันวิทยา สำหรับการตรวจวิเคราะห์หาโปรตีนที่สนใจอย่างจำเพาะเจาะจงในตัวอย่าง โดยอาศัยเทคนิครวมระหว่าง Electrophoresis และโปรตีนนั้นจะถูกย้ายจากแผ่นเจลไปยังแผ่นเมมเบรน จากนั้นตรวจสอบโปรตีนที่ต้องการโดยใช้แอนติบอดีที่จำเพาะต่อโปรตีนเป้าหมาย ทำให้สามารถวิเคราะห์หาโปรตีนที่สนใจได้

ขั้นตอนของการทำ Western blot มี 6 ขั้นตอน ดังนี้

1. การเตรียมตัวอย่าง (Sample preparation)

          ตัวอย่างชนิดต่างๆ เช่น แบคทีเรีย, ยีสต์, เนื้อเยื่อ หรือ เซลล์ จะต้องถูกย่อยโดยใช้ Lysis buffer เพื่อทำลายผนังเซลล์ และปั่นแยกเอาเศษเซลล์หรือส่วนอื่นๆที่ไม่ต้องการออก เพื่อให้ได้โปรตีนทั้งหมดออกมา ระหว่างขั้นตอนการสกัดควรเติมสาร Protease inhibitor เพื่อป้องกันโปรตีนถูกย่อยสลายด้วยเอนไซม์ Protease ที่มีอยู่ภายในเซลล์

2. การแยกโปรตีนด้วยกระแสไฟฟ้า (Electrophoresis)

          โปรตีนทั้งหมดที่อยู่ในตัวอย่างจะถูกแยกออกตามน้ำหนักของโมเลกุล (Molecular weight) ภายใต้สนามไฟฟ้าที่มี Polyacrylamide gel เป็นตัวกลางแผ่นเจลจะประกอบด้วย 2 ส่วน คือ stacking gel และ separating gel  โดยส่วน stacking gel จะเป็นส่วนของเจลชั้นบนสุด มีความละเอียดของเจลต่ำ เพื่อทำให้โปรตีนทั้งหมดมารวมอยู่จุดเดียวกัน และเริ่มต้นจากจุดเดียวกัน ส่วน separating gel เป็นเจลที่อยู่ต่อจาก stacking gel เป็นบริเวณที่ โปรตีนจะถูกแยกเป็นตามขนาดน้ำหนักโมเลกุล

3. การเคลื่อนย้ายโปรตีนจากแผ่นเจลลงสู่เมมเบรน (Protein transfer)

          เมื่อโปรตีนถูกแยกตามขนาดบน Polyacrylamide gel โปรตีนจะถูกย้ายลงสู่เมมเบรนที่มีประจุบวกเช่น Nitrocellulose หรือ Polyvinylidene fluoride (PVDF) ซึ่งในปัจจุบันเทคนิคที่ใช้สำหรับการเคลื่อนย้ายโปรตีนลงสู่เมมเบรน สามารถทำได้ 3 วิธีดังนี้

3.1) Wet electroblotting (Traditional wet or Tank transfer): เป็นเทคนิคดั้งเดิมที่เคลื่อนย้ายโปรตีนโดยอาศัยบัฟเฟอร์ที่อยู่ภายในแทงค์ ซึ่งวิธีนี้ต้องใช้บัฟเฟอร์ปริมาณมากและใช้เวลาประมาณ 60 นาที ถึง 120 นาที

>> Complete Mini Electro Blot System, MV-10CBS

รายละเอียดเพิ่มเติม: http://https://www.majorsci.com/product/6-1-mv-cbs

3.2) Semi-dry electroblotting (Semi-Dry transfer):  เป็นเทคนิคที่เคลื่อนย้ายโปรตีนแบบกึ่งแห้ง โดยอาศัยบัฟเฟอร์ปริมาณน้อย ที่ถูกดูดซัพโดย Blotting Filter Papers ทำให้วิธีนี้นอกจากจะประหยัดบัฟเฟอร์แล้วยังประหยัดเวลาอีกด้วย โดยใช้เวลาประมาณ 10 นาที ถึง 60 นาที

>> Semi Dry Mini and Semi Dry Midi, MSD series

รายละเอียดเพิ่มเติม: https://www.majorsci.com/product/7-0-msd

3.3) Dry electroblotting (Dry transfer) : เป็นเทคนิคที่เคลื่อนย้ายโปรตีนโดยแบบแห้ง โดยใช้คุณสมบัติพิเศษของเจลเมทริกซ์ ทำให้สามารถช่วยลดการใช้บัฟเฟอร์สำหรับเคลื่อนย้ายโปรตีนได้ นอกจากนี้ยังใช้เวลาเพียง 5 นาที ถึง 7 นาที เท่านั้น

4. Blocking เพื่อลดการเกิด Non-specific หรือป้องกันไม่ให้โปรตีนอื่นๆเข้ามาจับกับแผ่นเมมเบรน

          หลังจากเคลื่อนย้ายโปรตีนจากเจลลงสู่เมมเบรนแล้ว แผ่นเมมเบรนจะถูกนำไป Blocking ด้วย Bovine Serum Albumin (BSA) หรือ Non-fat dry milk  ซึ่งโปรตีนเหล่านี้จะจับบนที่ว่างของแผ่นเมมเบรน ยกเว้นบริเวณที่มีโปรตีนตัวอย่างจับอยู่แล้ว ดังนั้น Blocking จึงเป็นขั้นตอนที่มีความสำคัญ เพราะจะช่วยลดการเกิด Non-specific หรือป้องกันไม่ให้โปรตีนอื่นๆเข้ามาจับกับแผ่นเมมเบรนได้

          สำหรับในขั้นตอนการ Blocking จะต้องใช้เวลาครั้งละประมาณ 1 ถึง 2 ชั่วโมง ซึ่งใช้เวลาค่อนข้างนาน หากท่านได้ต้องการประหยัดเวลาสามารถใช้น้ำยาที่สามารถ Blocking และบ่มแอนติบอดีได้ในขั้นตอนเดียว

>> OneStep Blocker - Protein Free Western Blocking Solution and Signal Enhancer

รายละเอียดเพิ่มเติม: http://bio-helix.com/products/230

5. การติดตามผล (Detection)

          ในขั้นตอนการติดตามผลนั้นจะต้องใช้แอนติบอดีที่จำเพาะต่อโปรตีนที่เราสนใจ ซึ่งอาจมีการติดฉลากด้วยเอนไซม์ หรือสารเรืองแสงอื่น และเมื่อเอนไซม์หรือสารเรืองแสงทำปฏิกิริยากับสารตั้งต้นจะทำให้มีสีเกิดขึ้นหรือมีการเปล่งแสงออกมา ซึ่งแบ่งการติดตามผลเป็น 2 รูปแบบ ดังนี้

          Two-step detection เป็นการใช้แอนติบอดี เข้าไปจับกับโปรตีนอย่างจำเพาะ โดยใช้ 1o Ab จับจำเพาะต่อโปรตีนที่สนใจ บ่มเพื่อให้เกิดการจับกันอย่างสมบูรณ์ หลังจากนั้นทำการล้างเพื่อชะ Non-specific binding ออกไป แล้วจึงใช้ 2o Ab ที่ติดฉลากด้วยเอนไซม์ สารเรืองแสง หรือสารอื่นๆที่สามารถติดตามการเกิดสีหรือเรืองแสงได้ ซึ่ง 2o Ab จะเข้ากับกับ 1o Ab อย่างจำเพาะ (ดังภาพด้านล่าง)

          One-step detection เป็นการใช้แอนติบอดีที่มีการติดฉลากด้วยเอนไซม์ สารเรืองแสง หรือสารอื่นๆที่ เข้าจับกับโปรตีนเป้าหมาย ทำให้สามารถติดตามการเกิดสีหรือเรืองแสงได้ทันทีหลังจากเติมสารตั้งต้น โดยไม่ต้องใช้ 2o Ab เข้ามาจับอีกที (ดังภาพด้านล่าง)

ภาพแสดงการจับกันของแอนติเจนกับแอนติบอดีเพื่อการติดตามผล (Detection)

ที่มา: https://comis.med.uvm.edu/vic/coursefiles/MD540/MD540-Protein_Methods_Learning_Module_10400_593281210/Protein-methods/Protein_Methods7.html

สำหรับแอนติบอดีติดตามผลที่จำเพาะต่อโปรตีนต่างๆ สามารถผลิตได้เองหรืออาจจะซื้อมาสำเร็จรูปแบบพร้อมใช้งาน สามารถเข้าไปเลือกดูรายละเอียดแอนติบอดีที่มาในรูปแบบสำเร็จรูปเพิ่มเติมได้ที่: https://www.thermofisher.com/antibody/primary/query/filter/application/Western%20Blot

6. การวิเคราะห์ผล (Analysis) 

          เมื่อทำการบ่มแผ่นเมมเบรนด้วยแอนติบอดีที่จำเพาะต่อโปรตีนตัวอย่างแล้ว จะถึงขั้นตอนการติดตามว่าแอนติบอดีเข้าไปจับกับโปรตีนเป้าหมายในตำแหน่งใด ซึ่งการวิเคราะห์ผลขึ้นอยู่กับชนิดของฉลากที่ติดกับแอนติบอดี ในรูปแบบเอนไซม์ สารเรืองแสง หรือสารอื่นๆ สามารถแบ่งการวิเคราะห์ผลได้เป็นรูปแบบต่างๆดังนี้

• Colorimetric detection เป็นการติดตามผลโดยดูการเกิดสี ที่เกิดจากเอนไซม์ย่อยสารตั้งต้นแล้วเกิดแบนที่บนแผ่นเมมเบรนโดยตรง
• Chemiluminescent detection เป็นการติดตามผลโดยการเรืองแสง ซึ่ง Substrate ที่นิยมใช้กันคือ ECL Substrate จะถูกย่อยด้วยเอนไซม์ HRP แล้วทำให้เกิดการเรืองแสงขึ้นมา ซึ่งต้องอ่านผลด้วย Photographic filter หรือกล้อง CCD เพื่อจับภาพแบนบนเมมเบรน และสำหรับการเลือกใช้ ECL Substrate ขึ้นอยู่กับปริมาณตังอย่างของโปรตีนเป้าหมาย ตัวอย่างดังรายละเอียดด้านล่าง

>> UltraScence Pico Plus Western Substrate

รายละเอียดเพิ่มเติม: http://bio-helix.com/products/233

>> UltraScence Pico Ultra Western Substrate

รายละเอียดเพิ่มเติม: http://bio-helix.com/products/234

>> UltraScence Femto Western Substrate

รายละเอียดเพิ่มเติม: http://bio-helix.com/products/235

• Radioactive detection การติดตามเป็นวิธีนี้ไม่ต้องใช้ Substrate เพราะแอนติบอดี จะถูกติดฉลากด้วยสารรังสี ซึ่งจะเกิดการเปล่งแสงออกมา ต้องติดตามผลด้วยการประกบกับฟิล์มเอกซเรย์ - Fluorescent detection การวิเคราะห์และติดตามผลแบบนี้ แอนติบอดีจะถูกติดฉลากด้วยสารเรืองแสง (Fluorescent) ซึ่งจะต้องมีการกระตุ้น (Excitation) ในช่วงความยาวคลื่นที่เหมาะสม และมีการปล่อยแสง (Emission) ในช่วงความยาวคลื่นที่เหมาะสมเช่นกัน ดังนั้นจะต้องดูผลโดยการใช้กล้อง Photosensor เช่น กล้อง CCD ที่มีฟิลเตอร์กรองแสงในช่วงความยาวคลื่นตรงกันกับสารเรืองแสงเหล่านั้นในการจับภาพ

          สำหรับแอนติบอดีสำหรับการวิเคราะห์ผล สามารถผลิตได้เองหรืออาจจะซื้อมาแบบสำเร็จรูปแบบพร้อมใช้งาน สามารถเข้าไปเลือกดูรายละเอียดแอนติบอดีที่มาในรูปแบบสำเร็จรูปเพิ่มเติมได้ที่: https://www.thermofisher.com/antibody/secondary/query/filter/conjugates/HRP

          นอกจากนี้การประยุกต์ใช้เทคนิค Western blot นั้นขึ้นอยู่กับวัตถุประสงค์ในการทำงานแต่ทั้งนี้โดยหลักการพื้นฐานแล้วคือต้องการดูความจำเพาะของโปรตีนเป้าหมายในตัวอย่างกับแอนติบอดีที่ติดฉลาก การนำหลักการนี้ไปประยุกต์ใช้ เช่น งานทางด้าน Immunohistochemitry, ELISA หรือการทำตรวจยืนยัน HIV Test, RNAi และงานอื่นๆที่ต้องการดูการแสดงออกของโปรตีนอีกด้วย

ศึกษาข้อมูลเพิ่มเติม: https://www.thermofisher.com/th/en/home/life-science/antibodies.html

หรือติดต่อแผนก Technical support e-mail: TAS@3nholding.com หรือฝ่ายงาน Life Science product โทร 02-274-8331

บทความโดย: สุวิตรา เสถียรอนันต์กุล

ตำแหน่ง: Technical Application Specialist for Molecular Biology Products